RNA的分离提取与含量测定

锦锦添花

2021/11/30
实验猫

私聊

生命科学仪器综合讨论

一、酵母RNA的分离提取：

1、在1.5gNaOH溶于150mL水中加入15g酵母，配制成10%的酵母悬液；

2、室温搅拌30min，用6mol/LHCI中和至pH=7.0；

3、转至水浴锅上加热，90oC,10 min，移下并进行冰水浴，使温度迅速降至10oC.

4、放置冰柜中2h，上清与沉淀分离，沉淀离心（3000rpm，15min），合并两次上清；

5、上清用6mol/LHCL,调至pH=2.5，加入等体积的乙醇使RNA沉淀，置于冰箱中过夜，沉淀即为RNA粗制品，上清中含有多糖；

6、将4沉淀部分用少许水转至烧杯中，调体积至150ml，超声波处理10min（破壁），90oC加热，15min，以使细胞内容物充分释放。

7、离心（3000rpm，10min），所得沉淀调体积至100mL，超声波处理10min，90oC 加热，15min，合并两次上清，80oC水浴，浓缩至100mL左右，醇析（加2倍体积醇）得RNA粗制品，常温放置。

二、酵母核糖核酸的组成鉴定

取200mg提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分钟，制成水解溶液并进行组分的鉴定。

1、嘌呤碱取水解液1mL加入过量浓氨水，然后加入1mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。

2、核糖取1支试管加入水解溶液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中2分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。

3、磷酸取1支试管，加入水解液1mL和定磷试剂1mL.在水浴中加热30min，观察溶液是否变蓝色，说明磷酸是否存在。

三.酵母RNA含量测定

定磷法：

用浓硫酸将核酸消化，使其中的有机磷氧化成无机磷，而无机磷与定磷试剂中的钼酸铵反应生成磷钼酸铵，在一定酸度并有还原剂存在的条件下，其中的高价钼被还原成低价钼，从而生成深蓝色的还原产物——钼蓝。

H3PO4+12H2M0O4→H3P(M03O10)4+12H2O

钼蓝在660nm处有最大的光吸收值，在一定的磷浓度范围内，蓝色的深浅与磷的含量成正比。为了求得含磷量与吸光值之间的关系，必须先用标准无机磷溶液（KH2PO4）与定磷试剂反应，作出无机磷含量与吸光值关系的标准曲线。

为了消除核酸样品中原有无机磷的影响，应同时测定未消化核酸样品中的无机磷，并从总磷量中减去此无机磷量，才能代表核酸中真正所含的磷。

定磷法准确性好，灵敏度比较高，最低可以测定到每毫升10ug核酸的水平，因此可作为紫外吸收法和定糖法的基准方法。

【一】原液配制

将RNA样品配成5mg/mL溶液

将250mgRNA样品加少量氨水，<5mL,助溶

用水定容至50mL，作为原液待用

使用时根据需要进行稀释，如需要浓度为100g/mL，则稀释50倍即可.

（二）试剂配制

1、标准磷溶液

将KH2PO4预先置于105℃烘箱中，烘至恒重，放于干燥器内，降至室温。准确称取约0.1295g（含磷50mg，用水溶解，定容至50mL（含磷量为1mg/mL）。

作为贮存液置于冰箱中待用。测定时，取此溶液稀释100倍，使含磷量为10ug/mL．

2、定磷试剂

3mol/L硫酸：水：2.5%钼酸：10%抗坏血酸=1：2：1：1（按此顺序加入）

3、5mol/L硫酸

4、30%H2O2

（三）实验操作
1、标准曲线的绘制

试管号	标准磷溶液（mL）	水(mL)	相当于无机磷量（ug）	定磷试剂(mL)
1	0.0	3.0	0.0	3.0
2	0.2	2.8	2.0	3.0
3	0.4	2.6	4.0	3.0
4	0.6	2.4	6.0	3.0
5	0.8	2.2	8.0	3.0
6	1.0	2.0	10.0	3.0

将试管中溶液摇匀，45℃恒温水浴，保温25min，冷却至室温，在660nm处测定光吸收值。

（2）取两次平行操作的平均值，以标准磷含量（ug）为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

2、测总磷量

取2个微量凯氏瓶，1号瓶加0.5mL蒸馏水作空白对照, 2号瓶加入0.5mL制备RNA原液(5mg/mL, 含2.5mg/RNA);

向2个微量凯氏瓶中各加1.5mL,5mol/L的H2SO4,置于电炉上消化4h，待溶液呈黄褐色后，取出稍冷；

加2滴30%的H2O2，继续消化，至溶液透明为止，取出冷却；

加0.5mL蒸馏水，再沸水浴10min，以分解消化过程中形成的焦磷酸，然后将凯氏瓶内容物定量转移到50mL容量瓶内，定容；

取4支试管分两组，分别加1mL消化后定容的样品和空白溶液，进行定磷比色测定，从标准曲线中查出磷酸的g数，再乘以稀释倍数即得每mL样品中的总磷量。

3、测无机磷量

取2支离心管，其中1支加水0.5mL，另1支加0.5mLRNA溶液。

2支试管中各加0.5mL沉淀剂，3000r/min离心15min。

取上清0.1mL，加2.9mL水和3mL定磷试剂, 比色测定, 由标准曲线查出无机磷的g数, 再乘以稀释倍数就得每mL样品中的无机磷的g数。