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药物靶蛋白鉴定方法
小小矮马
2022/11/16
小矮马
私聊
生物制药
药物靶蛋白鉴定方法
非蛋白质组学鉴定方法
非蛋白质组学的传统药物靶蛋白鉴定方法,如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的迁徙分析等方法,通常耗时、耗力且不适合进行高流通量的筛选。目前,所使用的技术包括:第一,蛋白鉴定的图象分析,利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量,未被修饰的小蛋白错误率大约
30%
,而翻译后修饰蛋白错误率更高,故需联合其他技术完成鉴定;第二,微量测序,首先使经凝胶分离的蛋白直接印迹在
PVDF
膜,经过一系列操作后将其置于测序仪中进行蛋白质鉴定,但该方法仍然存在一些缺点,如由于酸性水解或者部分降解而产生氨基酸的变异,故应联合其他的蛋白质属性进行鉴定。
化学蛋白质组学方法
化学蛋白质组学方法一般先将小分子化合物通过与蛋白质溶液反应,使化学探针或小分子化合物与固相联接,得到被修饰的固相微球,然后利用合适的分离技术将这些蛋白质纯化,结合
LC-MS
分析,得到靶蛋白的信息。
亲和色谱法
亲和色谱法是化学蛋白质组学策略中较为经典的方法之一,它主要应用于研究蛋
白质与生物活性小分子或蛋白质与蛋白质的相互作用
[17]
。该方法通过官能团将配体结合在固相基质中,然后与蛋白质孵育,此时与配体结合的蛋白会留在基质上,最后通
过变性或与自由配体竞争将结合蛋白洗脱下来,再通过凝胶电泳或者
LC-MS
进行分
析。该方法的缺陷在于所研究分子衍生物活性不确定、材料配体结合力差异性以及非特异性吸附都将会干扰研究结果。
基于活性的化学蛋白质组学技术
基于活性的化学蛋白质组学技术(
ABPP
)是广泛使用的技术之一。
ABPP
是由美国的
Cravatt
课题组在
2002
年首次提出,最早用于酶谱分析,之后被应用于药物靶蛋白筛选。
ABPP
技术的关键是合成同时带有反应基团和标记物的
ABPP
探针,可进一步与待测的蛋白质发生相互反应。药物靶点筛选领域设计的
ABPP
探针通常包括三
3
个功能部分:反应基团、连接基团和报告基团。与二维凝胶电泳法(
2-DE
)、同位素编码亲和标签(
ICAT
)等技术相比,
ABPP
技术着重研究蛋白质的表达和功能,
可从天然蛋白质组样品中直接筛选出与小分子特异性结合的蛋白质,从而能更直接快速地明确小分子和蛋白质之间的相互作用,确定小分子的作用靶点,这对于筛选具有低亲和力的靶蛋白极为有利。另外,根据富集和鉴定策略的不同,
ABPP
技术可分为竞争性标记方法和生物正交的探针模拟物标记方法。
1.%2.%3
非化学修饰的蛋白质组学方法
1.1.%3.%4
细胞热位移测定
在过去
20
年中,热位移分析(
TSA
)已成为最广泛使用的无修饰药物靶点发现方法之一。这种方法简单直接,但探针无法区分不同的蛋白质,因此
TSA
仅适用于纯化蛋白质的实验。为了规避这个问题,
Molina
等人开发了一种概念上相似的技术,称为
细胞热位移测定
(
C
ETSA
)
,用于直接研究细胞环境中的药物
-
靶标相互作用。如图
(
A
)所示,细胞裂解物或完整细胞的多个等分试样首先用药物或载体处理,加热到不同的温度并冷却,然后通过离心分离出可溶性部分。随着温度的升高,蛋白质逐渐展开以暴露疏水核,导致蛋白质在高温下沉淀。蛋白质越稳定,蛋白质对热诱导沉淀的抵抗力越高,因此,可以测定可溶性蛋白质随温度变化的稳定性曲线。例如,该
方法通过叶酸
抗癌药物
甲氨蝶呤
与
二氢叶酸
还原酶的结合、雷替曲塞与胸苷酸合成酶的结合进行了药物靶标的验证。
CETSA
是一种允许研究活细胞中药物靶点的方法。
CETSA
结合小分子库可用于筛选潜在抑制剂、评估靶标参与效率和监测靶标特异性。此外,
CETSA
还可用于筛选
新药和表型化合物的靶点,解决脱靶蛋白、结合机制、药物疗效和完整细胞耐药性等
问题。
1.2.%3.%4
热蛋白组学分析
热蛋白组学分析(
TPP
)首先将蛋白在有或无活性小分子情况下孵育,并加热到不同的温度以诱导蛋白变性,剩余的可溶性蛋白用缓冲液提取。如图所示,在每个温度下,可溶性蛋白通过高分辨质谱进行量化,画出变性曲线,进一步测
4
定热稳定性和识别配体引起的变化。其中,
50%
蛋白发生聚沉时的温度为
Tm
(
melting temp
e
r
a
tur
e
)
,通过对比加药前后
T
m
的变化,确定活性分子的靶蛋白。
TPP
可以
通过定量
MS
分析,在蛋白质组水平评估活细胞中活性分子与蛋白结合的情况。
图
(
A
)
细胞热位移测定和
(
B
)
热蛋白组学分析简要工作流程
[14]
药物亲和反应的靶点稳定性技术
药物亲和反应的靶点稳定性技术(
DARTS
)是一种鉴定药物靶标的新方法。药物
与靶蛋白结合后,靶蛋白对蛋白酶的敏感性降低,与对照组相比,药物结合蛋白更不
易水解
。这种差异可通过蛋白凝胶电泳和质谱等技术对差异蛋白进行鉴定,可以确定
药物直接作用的靶点蛋白
,最大优势是不需要对药物进行任何化学修饰,即可以确定药物的直接结合蛋白。
DARTS
在天然小分子靶点的鉴定中发挥了重要的作用,例如
对
ecumicin
、白藜芦醇
(
resveratrol
)
等多种天然产物蛋白靶点的鉴定
。但
DARTS
也存在局限性,例如细胞裂解液中的低丰度蛋白的鉴定和非特异性结合会导致
蛋白对蛋白酶的敏感性升高增加。利用这一特性,研究者还开发了药物亲和力响应靶稳定性的方法用于药物靶点筛选。
附件:
12药物靶蛋白鉴定方法.docx
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