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关于氮气纯度对于LC-MS测定遗传毒性杂质灵敏度的影响

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2022/12/01

私聊

液质联用（LCMS）

前言

目前，对于LC-MS测定遗传毒性杂质大部分研究机构采用的是氮气钢瓶或者氮气发生器供给氮气来进行测定，从成本控制上考虑，采用氮气发生器具有成本上的优势，采用氮气钢瓶具有稳定输出高纯度气源的优点。

正常条件下，不考虑LC-MS仪器设备因素，氮气纯度越高，基线噪音越低，灵敏度越高。高纯度氮气是保证高灵敏度测定遗传毒性杂质限度级别达到百万分之一，甚至千万分之一限度的基础。笔者通过测定盐酸二甲双胍片中DNMA遗传毒性杂质，对采用不同厂家氮气发生器、钢瓶测定DNMA（千万分之一限度级别）进行了对比试验，试验显示采用北京安泰瑞科科技有限公司生产的Guardian系列ATEN-60型氮气发生器完全满足对于痕量分析测定的要求。

仪器性能设备特点

笔者对比采用国内外不同厂家氮气发生器产生的氮气纯度，发现分离原理不同产生的氮气纯度就有所不同，根据不同分离原理产生氮气纯度结果见下。

表 1 不同厂家仪器设备氮气纯度对比

厂家	安泰瑞科氮气发生器（国产）型号：Guardian系列ATEN-60型	PEAK氮气发生器（进口）型号：PEAK 1024
分离原理	PSA变压吸附分离技术	中空纤维膜分离技术
最大气流量	60L/min	30L/min
理论氮气纯度	≥99.5%	≥99.5%
实测氮气纯度	99.9%	94.5%

盐酸二甲双胍片（250mg）中NDMA测定

NDMA的遗传毒性数据库中TD50值为96ng/kg/d，根据盐酸二甲双胍片最大日服用量计算其限度结果应为0.037ppm，通过采用氮气钢瓶，国产氮气发生器和PEAK进口氮气发生器对比测试灵敏度，证明氮气纯度影响其测定的灵敏度，本品最终采用国产安泰ATEN-60型氮气发生器对本品进行了方法学验证。

1.试剂及对照品

表 2 试剂名称、级别

名称	批号	级别	来源
甲醇	2020MG009	HPLC Grade	康科德
水	20200623H	蒸馏水	屈臣氏
甲酸	RH215867	MS Grade	罗恩试剂

表 3 对照品信息

名称	分子式	批号	含量	来源
N-亚硝基二甲胺（NDMA）	C₂H₆N₂O	510166-202003	99.7%	中国食品药品检定研究院

2.样品信息

表 4 样品信息

名称	批号	来源
盐酸二甲双胍片	210201	悦康药业集团股份有限公司
空白辅料	20210226	悦康药业集团股份有限公司

3.仪器设备

表 5 设备和仪器列表

名称	型号	厂家
十万分之一天平	MS205DU	METTLER TOLEDO
液相色谱-质谱联用仪	QTRAP 5500PLUS	AB SCIEX
医用低速离心机	DT5-2	北京时代北利离心机
氮气发生器（国产）	Guardian系列ATEN-60型	北京安泰瑞科科技有限公司
PEAK氮气发生器（进口）	PEAK 1024	PEAK
氮气钢瓶	氮气纯度99.9999%	/

4.色谱方法

4.1液相色谱条件

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（ACE Excel 3 C18-AR，4.6×100mm），以0.1%甲酸水溶液为流动相A，含0.1%甲酸甲醇溶液为流动相B，照下表进行梯度洗脱，流速为0.6ml/min，柱温箱温度为30℃，进样体积为5μl。

时间（分钟）	流动相A%	流动相B%
0.00	95	5
1.00	95	5
3.00	80	20
7.00	0	100
9.00	0	100
14.00	95	5

4.2质谱条件

以三重四级杆串联质谱仪检测，采用APCI电离源，正离子模式（APCI⁺）；检测模式为多反应监测（MRM）。采集时间为0~3分钟，溶剂切换阀门时间为1.5~2.5分钟进入质谱采集。

离子对参数设置如下表：

名称	离子对	去簇电压DP(V)	入口电压EP(V)	碰撞能量CE(V)
定量离子对	75.1/43.1	60	10	20
定性离子对	75.1/58.1	60	10	15

离子源参数设置如下表：

气帘气

CUR

雾化气

GS1

碰撞气

CAD

雾化气电流

20 psi

40 psi

9 psi

3mA

4.3供试品溶液配制

空白溶剂取甲醇2ml，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为空白溶剂。

对照品贮备液的制备取N-亚硝基二甲胺约10mg，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含50ng的溶液，作为对照品贮备液。

线性系列溶液的制备精密量取对照品贮备液适量，加水定量稀释制成每1ml中约含0.5、1、2、10、20、50ng的溶液，作为线性系列溶液。

灵敏度溶液的制备精密量取对照品贮备液适量，加水定量稀释制成每1ml中约含0.5ng的溶液，作为灵敏度溶液。

系统适用性溶液精密量取对照品贮备液适量，加水定量稀释制成每1ml中约含10ng的溶液，作为系统适用性溶液。

供试品溶液的制备取本品，研细，取细粉适量（约相当于盐酸二甲双胍500mg），精密称定，加入4ml甲醇，涡旋2分钟，超声5分钟，振摇5分钟，离心，取一定量上清溶液加水稀释5倍涡旋离心后，取上清溶液作为供试品溶液（相当于500mg盐酸二甲双胍用20ml溶剂溶解）。

系统适用性要求

6针系统适用性溶液主峰峰面积RSD应≤10.0%；灵敏度溶液色谱图中，NDMA峰的信噪比应不低于10。

式中：

C_U：供试品溶液中N-亚硝基二甲胺浓度，ng/ml；

M_U：供试品称样量，mg；

M：样品平均片重，mg；

20：供试品溶解或稀释体积，ml；

250：为盐酸二甲双胍片标示量，0.25g，即250 mg。

5.方法建立

5.1专属性

空白溶剂：取甲醇2ml，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

空白辅料溶液：取空白辅料约150mg，精密称定，加入4ml甲醇，涡旋2分钟，超声5分钟，振摇5分钟，离心，取一定量上清溶液加水稀释5倍涡旋离心后，取上清溶液即得。

对照品贮备液：取N-亚硝基二甲胺约10mg，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含50ng的溶液，备用。

系统适用性溶液：精密量取对照品贮备液适量，加水定量稀释制成每1ml中约含10ng的溶液，作为系统适用性溶液。

供试品溶液：取本品，研细，取细粉适量（约相当于盐酸二甲双胍500mg），精密称定，加入4ml甲醇，涡旋1分钟，超声5分钟，振摇5分钟，离心，取一定量上清溶液加水稀释5倍涡旋离心后，取上清溶液作为供试品溶液（相当于500mg盐酸二甲双胍用20ml溶剂溶解）。

取空白溶剂、空白辅料溶液、供试品溶液分别进样分析，专属性结果见表5，取系统适用性溶液连续进样6针，结果见表6。

表 6 专属性结果

序号	名称	保留时间（分钟）	峰面积
1	空白溶剂	/	/
2	空白辅料	/	/
3	供试品	/	/

表 7 进样精密度结果

峰面积						平均值	RSD%
1	2	3	4	5	6	平均值	RSD%
303000	327000	342000	312000	318000	321000	320500	4.2

可接受标准：空白溶剂、空白辅料溶液及供试品溶液中均应无杂质峰干扰NDMA检测，供试品中未检出NDMA；6针系统适用性溶液主峰峰面积RSD应≤10.0%。

结论：空白溶剂、空白辅料溶液及供试品溶液中均无杂质峰干扰NDMA检测，专属性结果满足要求；系统适用性溶液连续进样6针，峰面积的RSD为4.2%，小于10.0%，进样精密度良好。

5.2定量限（灵敏度）

本品分别采用氮气钢瓶、安泰国产ATEN-60型氮气发生器和进口PEAK 1024型氮气发生器在限度浓度下（0.037ppm）灵敏度测试，结果显示使用氮气钢瓶和安泰国产ATEN-60型氮气发生器满足测定要求，采用进口PEAK 1024型氮气发生器不能满足方法灵敏度，为了进一步节约成本，故本品在采用安泰国产ATEN-60型氮气发生器条件下进行了定量限测定。

定量限溶液：取对照品贮备液溶液适量，用稀释剂稀释至信噪比≥10，即得。结果如下：

图1 氮气钢瓶空白溶液

图2 氮气钢瓶输送氮气限度浓度（1ng/ml）

图3 安泰氮气发生器输送氮气空白溶液

图4 安泰氮气发生器输送氮气限度浓度（1ng/ml）

图5 PEAK氮气发生器输送氮气空白溶液

图6 PEAK氮气发生器输送氮气限度浓度（1ng/ml）

图7 安泰氮气发生器输送氮气定量限（0.5ng/ml）

结果显示：采用NDMA限度浓度测定，氮气钢瓶输送氮气测定灵敏度高于安泰氮气发生器，安泰氮气发生器输送氮气测定灵敏度高于PEAK氮气发生器，相同条件下采用PEAK氮气发生器输送氮气测定NDMA不能够正常测定，灵敏度达不到要求，故为了节约成本，本品采用安泰国产ATEN-60型氮气发生器输送氮气条件下测定定量限，以NDMA信噪比≥10，测得定量限浓度为0.5ng/ml，该灵敏度满足该方法测定的灵敏度要求。

5.3 线性与范围

对照品贮备液：同专属性项下。

L1-L6线性溶液的制备：按照表7使用对照品贮备液配制相应浓度的线性溶液，混合均匀并标注。

表 8 线性溶液的配制

编号	（移液管→容量瓶）	溶液浓度（ng/ml）
L1	对照品贮备液	50
L2	4ml→10ml	20
L3	2ml→10mL	10
L4	1ml→25ml	2
L5	0.5ml→25ml	1
L6	0.5ml→50ml	0.5

取线性系列溶液分别进样分析，用峰面积和浓度绘制标准曲线，计算线性回归方程，结果见表8。

表 9 线性试验结果

浓度（ng/mL）	0.53	1.07	2.13	10.66	21.32	53.30
峰面积	26900	45800	60700	308000	617000	1560000
线性方程	y = 29092x + 4818.8
相关系数R²	0.9998
线性回归图

数据源：210118- P7

结果显示：线性范围试验结果显示本品在0.53~53.30ng/ml浓度范围内，NDMA的峰面积与其浓度呈良好的线性关系，其线性方程为y = 29092x + 4818.8， R²=0.9998。

5.4重复性

标准曲线系列溶液的制备：见线性范围试验项下。

加标供试品溶液的制备：取本品，研细，取细粉适量（约相当于盐酸二甲双胍500mg），精密称定，加入4ml甲醇，涡旋1分钟，超声10分钟，振摇10分钟，离心，精密量取上清溶液2ml，取10ng/ml的对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，涡旋离心后，取上清溶液作为供试品溶液（平行配制6份）。

取上述溶液分别进样分析，结果见表9。

表 10 重复性试验结果

含量（ng/ml）						平均值	RSD%
1	2	3	4	5	6	平均值	RSD%
1.312	1.261	1.288	1.254	1.233	1.147	1.249	4.6

结果显示：测定的6份供试品中NDMA的平均含量为1.249ng/ml，RSD为4.6%，小于15.0%，说明该法重复性良好。

6.样品测定

本品采用经过方法学验证的方法测定多批样品，结果如下：

表 11 多批样品测定结果试验结果

批号	限度	210201	210202	210203	210204	210205
NDMA（ppm）	0.037ppm	未检出	未检出	未检出	未检出	未检出

结论：采用国产氮气发生器输送氮气测定盐酸二甲双胍片中NDMA满足测定的要求，本品经过方法学验证显示其灵敏度满足测定的要求。

讨论：不同的品牌质谱检测器需要的供气氮气总流量有所不同，研发成本就存在了显著区别，为了节约成本，选择能够持续稳定的输出高纯度氮气发生器厂家仪器，成为保证正常使用氮气流量较大质谱检测器的首选必要条件。例如：AB SCIEX Triple Quad? 5500+质谱检测器，每路供气流量10L/min，三路供氮气，流量达到了30L，如果采用钢瓶供气，则得采用160升或者180升的高压液氮罐，三天基本就使用完毕，而且装满钢瓶后有将近300kg，搬运极不方便，由于实验时使用的氮气流量较大，耗费的成本达到将近400元/天，三十天连续使用则达到10000多元的月成本，费用极高，故不宜采用氮气钢瓶进行试验供气。

LC-MS测定微量分析中遗传毒性杂质，不考虑仪器因素，氮气纯度对方法的灵敏度有很大影响，氮气纯度越高，测定方法的灵敏度越高，故为了节约成本采用合适性价比的氮气发生器非常重要。《以上转自丁香园论坛lzwlzw楼主老师》

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