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抗体标记的方法及注意事项有哪些?
Ins_bf0c01c3
2023/08/29
私聊
生命科学仪器综合讨论
什么是抗体结合?抗体结合也被称为
抗体标记
,是一种可将特定标记物共价连接到抗体分子上的抗体修饰技术。这些标记抗体可用于从细胞,组织,或者整个个体的混合物中分离和纯化的目的蛋白。
辣根过氧化酶(
HRP
)是最常见的抗体酶标记类型。
HRP
上仅有
6
个赖氨酸,而且它们的修饰并没有较多的影响酶活性。常见的荧光染料有
FITC
、
PE
、
APC
和
PerCP
等,均可用于标记抗体。
除了为客户提供抗体开发,义翘神州还可以提供抗体标记服务,可提供的标记物包括
HRP
、生物素、荧光基团等。
标记方法:
(
1
)标记抗体、抗原:常用于标记抗体的活化生物是
BNHS
;对于偏酸性的抗原,标记时多采用
BHZ
;
(
2
)标记酶:以生物素标记
HRP
为例。
标记注意事项:
1.
待标记物的蛋白浓度不能过低,如若浓度过低需经超滤浓缩等手段提高浓度至
0.1mg/mL
以上。
2.
一个蛋白质可能被多个生物素标记,标记时,生物素与待标记物应有合适的比例,确保标记后不影响待标记物的活性。推荐生物素:抗原蛋白比例为
1~3
:
1
,生物素:抗体比例为
5~20
:
1
或根据标记试剂盒说明书推荐比例。
3.
为减少空间位阻影响,基于检测灵敏度特异性等要求,可在生物素与被标记物之间加入交联臂结构。
4.
如果偶联基团为氨基,待标记物的系统不得含有游离的氨基(
Tris,
氨基酸)、载体蛋白(
BSA
)或者其他干扰物,若有干扰物需要用标记缓冲液反复超滤确保其去除干净,若采用其他基团偶联试剂,待标记物系统亦不能有含对应的游离基团的物质。
5.
如果待标记物为分子量较小的物质,在纯化过程中注意超滤管、脱盐柱、透析袋的截留分子量。
6.
标记反应后的体积量至少在
100
μ
L
以上,以达到纯化时的最小上样量。
7.
标记反应完成后(氨基偶联体系),可在体系中加入适量的含游离含氨基小分子物质,中和游离的生物素活化试剂,提高纯化效率,减少后续反应的假阳性和高背景。
8.
纯化后的标记蛋白可采用
A280
或
BCA
法测定蛋白含量。
9.
标记纯化后的蛋白可根据蛋白性质进行分装长期保存,减少冻融次数。
更多抗体标记详情可以参考:
https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-conjugation
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