以肝癌组织单外泌体表面蛋白组为基础的肝癌预后模型构建
1、 ：
研究内容
从肝细胞肝癌和癌旁组织中提取外泌体，深入探讨肝癌组织外泌体和癌旁组织外泌体的差异，通过生物信息学手段发现关键分子，并通过实验验证关键分子的作用，结合临床信息构建肝癌预后模型，具体研究内容为：
1）临床样本收集：收集肝细胞肝癌和癌旁组织20例，分别提取外泌体；后期验证收集肝细胞肝癌和癌旁组织80例。
（2）外泌体表面蛋白测定及关键分子检测：前期采?邻近编码技术（Proximity Barcoding Assay, PBA）对单外泌体进行分析，对样本中的外泌体进行高通量、单颗粒、多种蛋白的检测；miRNA组学分析：与疾病发生相关的外泌体源功能分子；差异分子的功能、通路的富集与注释；组织外泌体验证关键分子；关键分子上下游通路预测、功能富集、表型预测；
（3）功能机制研究：获得或缺失关键分子后的外泌体处理肿瘤细胞，检测干性表型；体内实验验证其对小鼠成瘤的影响。
1、 研究方案：
1.研究方案（有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明，项目可行性分析）
研究方法
（1）临床样本收集：收集肝细胞肝癌和癌旁组织20例，分别提取外泌体；
（2）外泌体表面蛋白测定及关键分子检测：前期采用邻近编码技术（Proximity Barcoding Assay, PBA）对单外泌体进行分析，对样本中的外泌体进行高通量、单颗粒、多种蛋白的检测；miRNA组学分析：与疾病发生相关的外泌体源功能分子；差异分子的功能、通路的富集与注释；组织外泌体验证关键分子；关键分子上下游通路预测、功能富集、表型预测；
（3）功能机制研究：获得或缺失关键分子后的外泌体处理肿瘤细胞，检测干性表型；体内实验验证其对小鼠成瘤的影响；
（4）预后模型的构建：将临床信息与关键分子信息相结合，构建肝癌预后模型。
实验方案
一、组织外泌体的提取
1.组织切片解离，获得外泌体悬液
（1）冰冻切片机对组织进行切片处理,
（2）将提前配好的消化酶转移到50 ml的离心管中。
（3）将装有切片组织的离心管转移至于37℃水浴锅中水浴孵育 10-15 min，过程每隔 5 min充分混合一次观察组织形态消化情况。
（4）37℃孵育结束后将组织消化混合液放置在冰上，用70 μm滤膜过滤上述溶液到新的15 ml的离心管中。
（5）向每个15 ml的离心管中加入 25 ul 蛋白酶和磷酸酶抑制剂（1:100）。
2.外泌体悬液差速离心
（1）4℃，300×g，离心 10 min，转移上清到新的 15 ml 离心管中。
（2）4℃，2000×g，离心 10 min，转移上清到新的 15 ml 离心管中。
（3）4℃，10, 000×g，离心 20 min，上清转移到新的 15 ml 离心管中。
（4）步骤（3）得到的上清液用 10 ml 注射器通过 0.22 μm 滤膜过滤进入大超离管中。
（5）4℃，150,000 ×g，超离2 h。
（6）超离结束后，弃上清，沉淀以0.4 ml+0.4 ml遇冷的PBS（含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂）溶解后，获得小囊泡。
3. SEC 排阻+超滤
（1）将超离后1 ml的PBS洗涤的外泌体加入到排阻柱中，待液面下降至上筛板时，依次加入PBS，并同时
（2）收集对应馏分加入 100kd 超滤管中。
（3）4℃，4000×g，离心 1min。
（4）超滤至合适体积后，对着滤膜反复吹打，吸出200 ul后进行BCA蛋白浓度检测。
4. BCA检测
将超滤得到的外泌体进行BCA蛋白浓度检测。
二、外泌体表面蛋白及miRNA组学分析
1. 与疾病发生相关的外泌体源功能分子，差异分子的功能、通路的富集和注释。
2. 组织外泌体验证关键分子，供体细胞的推断。
3. 关键分子上下游通路预测，功能富集，表型预测。
4. 预后模型的构建：将临床信息与关键分子信息相结合，构建肝癌预后模型。
三、功能机制研究
1. 获得或缺失关键分子后的外泌体处理肿瘤细胞，检测干性表型。
2. 体内实验验证其对小鼠成瘤的影响：经溯源分析得出不同亚群外泌体的来源，将特定来源的外泌体注入小鼠体内，研究其对小鼠成瘤的影响。
可行性分析
本课题组前期进行了外泌体提取的相关研究，已取得学术成果。
1）科研基础扎实：申请者研究团队从事相关基础研究多年，近年在国内外期刊上发表论文多篇，具备高质量完成项目的能力。
2）研究目标切实：本课题密切联系外泌体研究现状，旨在研究组织外泌体与疾病关系，并为疾病的诊断和治疗提供切实合理的方案。
3）技术平台与硬件设施完善：申请者所在单位的分子生物学及生物信息学各项研究方法比较成熟，具备完成实验所需的全套设备，并且已熟练掌握上述技术路线涉及的各种实验方法。
4）项目组成员近年来连续从事外泌体捕获及分离方法研究，熟悉该研究领域的动态前沿，有一定的研究功底。
5）本项目的研究团队人员配置合理，骨干成员均为年富力强的中青年科学工作者和技术骨干，有较强科研履约能力和良好履约记录。
创新点：
目前对于外泌体的研究大多局限于体液外泌体，体液来源的外泌体在疾病研究和早诊方面存在一定的局限性。首先，体液外泌体来源于机体内的各种细胞、组织导致其组成复杂，鉴定出的标志物是否为肿瘤所特异并无清晰阐述。其次，组织微环境中包括肿瘤细胞和其他各种细胞的复杂作用。本研究直接从组织中提取的外泌体（Ti-EVs）具有组织特异性、准确反映组织微环境以及携带更丰富的信息等优点。
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