O-GlcNAc糖基化修饰蛋白质和肽段的分离与富集新策略
作为O-GlcNAc成功鉴定的前提，糖肽的分离富集一直是国内外研究的重点。近年来，针对O-GlcNAc糖基化修饰丰度低，质谱响应性差，难以实现高灵敏度、规模化分析等难点，发展了凝集素法、抗体富集法、亲水富集法等多种针对O-GlcNAc糖基化修饰蛋白质和肽段的分离与富集新策略。[7-8]
凝集素作为一类糖结合蛋白，能专一识别某种单糖或聚糖结构，并与之可逆的共价结合，因此被广泛应用于糖基化蛋白的分离富集中，其中，小麦胚芽凝集素（WGA）是富集O-GlcNAc糖肽的常用策略。[9]WGA以二聚体形式作用，每个单体含有4个结合位点，识别专一性不高，对聚糖的亲和力高，对单糖亲和力比较低，对糖链末端的唾液酸（sialic acid）、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）以及壳二糖（chitobiose）等结构均有识别。由于O-GlcNAc是单糖修饰，直接用WGA富集特异性比较差。针对存在问题，Wosseller等人制备了一种基于WGA的凝集素层析柱，发展了一种凝集素弱性亲和色谱法（LWAC）对O-GlcNAc糖蛋白进行分离富集鉴定。利用装有WGA偶联珠的长柱，用低流速等压洗脱分离O-GlcNAc肽，O-GlcNAc肽由于与材料的亲和作用而被柱阻滞，从而实现分离富集。除此以外，琥珀酰化后的小麦胚芽凝集素（sWGA）可以实现对末端GlcNAc糖链的特异的亲和性，专一性有所改善，但结和力减弱。因此，凝集素方法依然存在制备困难、成本高、稳定性差、亲和力和选择性不足等缺点，影响O-GlcNAc糖肽的高效分离富集。
基于抗体的富集方法比凝集素法拥有更好的亲和力和特异性，是最简单的O-GlcNAc糖肽富集方法之一，运用O-GlcNAc泛特异性抗体，可以识别O-GlcNAc连接的丝氨酸或者苏氨酸残基，目前用到的主要有两种RL2和CTD110.6，但是这些抗体往往具有位点依赖性，需要结合多个单糖才能表现出较强的亲和力，存在亲和力不够高的问题，多个抗体联合使用则会提高富集特异性。[10]Wells等人通过对抗体富集策略进行改进发展，开发了新前处理方式等手段，从小鼠的突触组织样本中鉴定到1750个O-GlcNAc修饰位点，大大提高了O-GlcNAc糖肽鉴定的准确度和广泛性。抗体较凝集素而言，特异性更强，结合力更大，但价格昂贵，易产生非特异性吸附导致假阳性结果，且单抗富集的O-GlcNAc糖肽具一定的选择性，每种抗体富集到的O-GlcNAc糖肽重合度不高，因此，普适性通用性抗体的开发成为了基于抗体富集O-GlcNAc糖肽研究的关键。
亲水富集方法利用糖肽中聚糖的羟基与固定相之间的亲水作用进行O-GlcNAc糖肽的分离富集，Qian等人利用表面引发原子转移自由基聚合(SIATRP)合成了亲水聚合物改性二氧化硅微粒，微粒子表面密集填充聚乙二醇，具有高度亲水性，为O-GlcNAc肽的保留提供强大的HILIC相互作用。利用该材料从人的尿液样本鉴定到470个O-GlcNAc肽，457个O-GlcNAc蛋白，大大提高了O-GlcNAc糖肽鉴定的覆盖度。但仍然存在假阳性较高的问题。[11]
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