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蛋白过镍柱纯化的科学原理及详细步骤

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    2023/11/01
  • 私聊

生命科学仪器综合讨论

  • 蛋白过镍柱纯化的原理是利用Ni柱中的氯化镍与有HIs(组蛋白)标签的蛋白特异性结合的能力,同时也能与咪唑结合。具体步骤如下:



    过柱子前可以选择Ni柱重生,往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行,然后平衡柱子,用你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境。

    平衡4个柱长后,蛋白上样,可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些。如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差。也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。

    挂完之后,按理想来讲,蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多数在烧杯里留下来了。肯定有少量杂蛋白也挂上了。这时候要梯度洗脱,拿咪唑和你的buffer配,一般从020mM40mM......100mM这样洗脱。咪唑加入之后,会和蛋白争夺与Ni的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来。

    洗完之后,可以用200mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次。是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~ 过的蛋白用不同的管子收下,然后SDS-page检测在哪个管子里。

    以上步骤仅供参考,不同的实验条件可能方法会不同。具体可以查阅专业书籍或者咨询专业人士。



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    杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达服务:https://cn.sinobiological.com/services/baculovirus-insect-protein-expression-service

    原核(E. coli)蛋白表达服务:https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service
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