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蛋白过镍柱纯化的科学原理及详细步骤
Ins_bf0c01c3
2023/11/01
私聊
生命科学仪器综合讨论
蛋白过镍柱纯化的原理是利用
Ni
柱中的氯化镍与有
HIs
(组蛋白)标签的蛋白特异性结合的能力,同时也能与咪唑结合。具体步骤如下:
①
过柱子前可以选择
Ni
柱重生,往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行,然后平衡柱子,用你自己的
buffer
,给蛋白提供最适的环境。
②
平衡
4
个柱长后,蛋白上样,可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些。如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差。也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。
③
挂完之后,按理想来讲,蛋白在
Ni
柱中与
Ni
就结合了,杂蛋白多数在烧杯里留下来了。肯定有少量杂蛋白也挂上了。这时候要梯度洗脱,拿咪唑和你的
buffer
配,一般从
0
、
20mM
、
40mM......100mM
这样洗脱。咪唑加入之后,会和蛋白争夺与
Ni
的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来。
④
洗完之后,可以用
200mM
咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次。是否选择重生你自己定咯
~
然后放上
20%
乙醇保存柱子就可以咯
~
过的蛋白用不同的管子收下,然后
SDS-page
检测在哪个管子里。
以上步骤仅供参考,不同的实验条件可能方法会不同。具体可以查阅专业书籍或者咨询专业人士。
义翘神州提供不同表达系统的
蛋白纯化服务
,有细菌系统蛋白纯化、
哺乳动物瞬时系统蛋白纯化
、杆状病毒系统蛋白纯化等,具体重组蛋白纯化原理及操作步骤可以查看
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification
杆状病毒
-
昆虫细胞蛋白表达服务:
https://cn.sinobiological.com/services/baculovirus-insect-protein-expression-service
原核(
E. coli
)蛋白表达服务:
https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service
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