抗体标记与检测的种类和方法详解

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2023/12/01

私聊

生命科学仪器综合讨论

抗体是生物体内重要的免疫分子，它们能够识别并攻击外部入侵者，如病毒和细菌。在医学、生物学和免疫学等领域，抗体标记与检测技术广泛应用于疾病诊断、治疗监测、药物研发等方面。本文将详细介绍抗体标记与检测的种类和方法，包括直接标记、间接标记、免疫荧光、酶联免疫吸附试验等。通过对这些技术的了解和应用，我们可以更好地利用抗体进行疾病诊断和治疗监测，提高医疗水平和治疗效果。

1.抗体与标记物

抗体广泛应用于多种免疫分析中，用于检测和定量抗原。直接识别抗原的抗体被称为一抗（primary antibody），赋予检测的特异性。同时，在检测中还需加入标记物（详见后文“间接标记法 Vs.直接标记法”），标记物的加入赋予可检测性。表1中列出了一些常用的免疫分析技术，及可能使用到的标记物。

免疫分析方法	标记物
免疫印迹(WB)	酶(通常为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP)
酶联免疫吸附试验(ELISA)	酶、生物素/链亲和素
免疫荧光(Immunofluorescence)	荧光染料
免疫组化(Immunohistochemistry)	酶、生物素/链亲和素
流式细胞术(Flow Cytometry)	荧光蛋白或染料、串联染料

2.直接检测法 Vs.间接检测法

检测技术可分为两大类：直接法和间接法。对于直接检测法，标记物通过共价键连接到一抗上。而对于间接检测法，标记物则是共价连接到与一抗特异性结合的二抗上。

在间接法中，检测由两个部分组成：第一步，用未标记的一抗进行孵育（通常1小时），(若存在抗原)部分抗体与抗原结合，未结合的抗体则通过洗涤去掉，然后加入标记二抗。再次孵育（通常1小时），洗涤去掉未结合的二抗。然后对结合在抗体上的标记物进行量化。若有抗原存在时，标记物通常导致有色物质的生成或某一个波长的发射光量增加。当无抗原存在时，则无一抗的结合，也无二抗试剂的结合，因此无信号产生。

在直接法中，标记物直接与一抗共价结合，因此仅需一轮孵育及洗涤步骤，而间接法则需要两轮孵育及洗涤步骤。直接法简化了试验的流程，但检测的灵活性降低。下表列举出了直接法/间接法的主要利弊。

方法	优点	缺点
直接法	仅需使用一抗，检测快速无二抗的非特异性结合	由于标记可能导致一抗的免疫反应性降低; 信号放大作用较弱
间接法	一抗含有多个标记，二抗可结合的表位，因而灵敏度升高，信号放大作用较强。	二抗可能发生非特异性结合; 孵育及洗涤步骤增多

尽管直接标记法具有诸多潜在的优点，但为何如今众多的免疫分析仍采用间接法原理呢?

无疑，最主要的原因就是直接标记一抗相对较复杂，确实从历来经验看，抗体标记都是由那些具有化学修饰技术的专业人员来完成的。在间接法中二抗试剂所起的信号放大效应究竟如何呢？是否直接标记法所产生的信号就很弱？其实在很多情况下，间接法的放大效应是让人产生错觉的。在与二抗试剂的孵育过程及洗涤过程中，一些一抗会与抗原发生解离，因此真正被放大的只是逐渐减少的一抗的量。其实在很多情况下，直接法也可获得与间接法相同甚至更好的结果。

3.常见的抗体标记方法

和所有蛋白质一样，抗体也是由氨基酸组成的。理论上，通过大多数氨基酸可以实现生物偶联。以下内容介绍了几种基于赖氨酸残基的抗体偶联和标记技术。

①NHS（琥珀酰亚胺）酯法

应用广泛的荧光染料（如罗丹明衍生物）是采用这种方法对抗体进行偶联。通常在磷酸盐缓冲液中进行，随后与未标记的染料在柱上进行分离。该方法的主要缺点是，由于酯类对水分敏感，酯类的稳定性差。因此，反应结束后，标记抗体应立即使用。

吉妥珠单抗（Gemtuzumab ozogamicin, Mylotarg®）是全球范围内首个获批上市的抗体偶联药物（ADC）。半合成的卡奇霉素衍生物具有NHS酯，以便将卡奇霉素与人源化IgG4的赖氨酸残基偶联。然而，由于患者的临床获益不足，Mylotarg®已于2010年退市。

②异硫氰酸盐法

这种方法主要用于异硫氰酸荧光素（FITC）染料的偶联，广泛用于荧光标记蛋白和抗体的制备。异硫氰酸盐比NHS更稳定，但也更难制备，而且利用该方法，标记的反应效率可能会降低。与NHS法一样，应在反应结束后通过层析法去除多余染料。

③碳二亚胺法

碳二亚胺衍生化合物将蛋白质上的羧基转换为反应中间体，可与赖氨酸发生反应。碳二亚胺的高反应性意味着它们可用于使用相对惰性的材料（如磁性或金颗粒）标记抗体。最常用的碳二亚胺为EDC。NHS有时可被添加至反应中，以辅助产生相对稳定的中间体。

该方法操作简单，但与NHS一样，EDS具有吸水性，因此，标记后抗体需立即使用。

④高碘酸盐法

这种方法可用于制备特异性的HRP标记抗体。高碘酸盐通过产生与赖氨酸残基相互作用的醛分子来激活HRP。HRP本身只有少量的赖氨酸残基，因此酶聚合的影响不大。HRP和抗体之间的键是可逆的，可通过添加氰基硼氢化钠使其保持稳定。

详情可以关注：https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-conjugation