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多重免疫荧光染色步骤和原理
Ins_bf0c01c3
2024/01/31
私聊
生命科学仪器综合讨论
多重荧光免疫组化技术
(Multiplex immunohistochemical
,
mIHC)
也称作酪氨酸信号放大
(Tyramide dignal amplification
,
TSA)
技术,是一类利用辣根过氧化酶
(Horseradish Peroxidase, HRP)
对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。
这一技术基于酪胺信号的放大效应,实现对单个细胞或组织样本上多个目标靶点的同时检测。这为全面研究细胞组成、细胞功能以及细胞间的相互作用提供了强大的工具。通过多重荧光免疫组化技术,科学家们可以更深入地了解细胞的奥秘,揭示生命现象的复杂性。
mIHC
实验原理及流程
TSA
技术采用
HRP
标记的二抗,
HRP
催化加入体系的
TSA
衍生荧光染料,生成活化荧光底物,活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合,将信号共价结合到抗原上。之后用热修复洗去非共价结合的抗体,再换下一种一抗来第二轮孵育,换另一种荧光素底物,如此往复就可实现多重标记。
原理:
带有染料标记的底物酪胺
(T)
分子在过氧化氢氧化环境下,被抗体或探针固定的
HRP
转化为具有短暂活性的中间状态
(T*)
,然后被激活的中间态分子
(T*)
迅速与相接蛋白分子的富含电子区域
(
酪氨酸残基
)
进行稳定的共价结合,未被标记的酪胺分子将被洗脱,借此实现对抗原的特异性染色。由于相接的蛋白
(
包括
HRP
,抗体,目标抗原
)
都含有大量的酪氨酸结合位点,所以目标抗原处会富集大量标记分子,使信号被有效放大 。
多重免疫荧光染色的步骤包括样品制备、抗原诱导、抗原解露等。
具体如下:
①样品制备:根据细胞或组织的不同,选择不同的处理方式。对于细胞样品,需要固定和渗透化处理以保持其形状和蛋白质结构。对于组织样品,需要切片并进行染色前的去脂处理。
②抗原诱导:如果目标标记物是蛋白质,那么需要选择适当的抗体来识别目标蛋白质。抗体可以人工合成或从动物体内提取。
③抗原解露:对于细胞样品,可以利用活液解离细胞,并将细胞固定在载玻片上。
IHC
与
mIHC
区别与联系
免疫组化
,是应用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原,对其进行定位、定性的研究。
简单来说,
mIHC
属于
IHC
的升级版本!
Tips
:
相同点:
能够完整显现组织原位形态信息。
不同点:
1.
常规免疫组化的分析属于定性分析,其判断大多依赖于经验,其分析结果会有差异。而多重荧光免疫组化属于定量分析,其利用软件可对组织中的细胞进行精准的结果分析。
2.
常规免疫组化受传统染色成像的限制,靶标少于
3
个,无法完整分析组分信息。而多重荧光免疫组化可实现多因子共定位,可以获取更多的生物信息,且样本需求量较少。
义翘神州提供的
TSA
法多重荧光免疫组化服务
,有一系列屏蔽自发荧光干扰的手段,配合激光共聚焦显微镜的拍摄条件,提供更优质的图像质量,收获更特异的染色结果。
https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services
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