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【“仪”起享奥运】下一代测序（NGS）技术在中药鉴定中的应用

小卡

2024/08/05

中药/天然药检测

进入21世纪，自第一个植物基因组拟南芥被完整破解以来，有近300种植物的基因组被陆续破解，并在此基础上建立了相应的植物基因组数据库，中药材植物是其中重要的组成部分。中药材品种数量众多，一项市场调查发现，123种常用的中药材都有不同程度的掺假或混用的情况。传统的DNA条形码技术虽然具有很好的物种区分能力，但是一般是针对单一的物种进行鉴定，碍于桑格测序的技术局限性，其对多药味的中成药的鉴别存在困难。NGS测序则可以解决多药味处方的鉴别的问题，目前已有许多关于NGS技术应用于中药材产品的报道。

Peng Zhang等尝试用Pacific Biosciences（PacBio）公司的单分子实时（Single-molecule Realtime，SMRT）测序技术对生脉散中各个药味进行检测，不同于传统的NGS测序，其开发了一种Full-lebgth Muiti-barcoding的策略，直接对ITS2和PsbA-trnH的片段进行了测序，并选择三味蒺藜散用于验证方法的可行性。最终通过不同通用DNA引物的组合可以实现对生脉散与三味蒺藜散中所有药味的鉴定，同时可以鉴定出外源性的物种，充分证明了此种方法用于中成药质量控制的可行性。由于龙胆泻肝丸中川木通的混用会引起马兜铃肾病，因此其质量检测要求比较严格，通过鸟枪法宏基因组测序技术使用Illumina HiSeq 2500平台对龙胆泻肝丸中的木通进行验证，从实验室制作的2个参考样本（RF01和RF02）中获得了ITS2、PsbA-trnH和MatK三个序列的共计129个有用的Contigs，实现了对木通及龙胆泻肝丸中其余药味样本的检测。将该方法应用于市场收集样本的检测，发现市场样品多存在产品投料缺失、伪品混用、川木通代替木通投料等情况，证明了该方法用于中药材尤其中成药质量控制方面具有可行性。Cheng等基于高通量测序方法开发了一种新的用于识别中药中生物成分的M-TCM方法，对六味地黄丸的生物成分进行分析。分析过程中选择了3批不同制造商的六味地黄丸的药材及自己实验室制备的参考样本，最终实现了对六味地黄丸中不同药味与外源性生物的检测，并通过该方法进一步验证了有些厂家以加工过的原材料进行投料生产的猜测。

目前对于天南星的化学检测方法较少，且天南星根茎具有毒性，Li等通过高通量测序与实时PCR技术检测在传统如意金黄散处方中是否存在掺伪的情况，并通过是否能鉴别如意金黄散中有毒的天南星及其混伪品虎掌来确定此方法的可行性。结果显示，市场收集的如意金黄散样品中未检测到天南星与厚朴，却检测到了虎掌和当归，实时PCR方法与NGS测序的检测结果一致，进一步验证了结果的准确性。Xin等[44]利用PACBIO RSII SMRT平台对3份市场来源和2份实验室自制的九味羌活丸样品进行测序，通过对ITS2和PsbA-trnH两种DNA条形码的测序结果分析，发现实验室自制的样品中所有的药味均被检出，而市场购买的样品中黄芩、苍术、白芷、川芎等药味未被检测到，同时朝鲜苍术、白术等非处方药味和外源性的物种例如杜鹃属、牵牛属等却有检出。Williams A等[48]利用PacBio平台结合PCRDGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）的方法检测当归补血方中处方药味的投料是否准确，并通过高效液相色谱的方法检测当归和黄芪中的1338质量标志物，确定其剂量关系。

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