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【金秋计划】轻松拿捏“胶回收DNA”

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2024/09/06

实验室管理/LIMS

一、割胶回收原理

DNA经琼脂糖凝胶电泳后，切下要回收的含DNA的琼脂块，采用DNA胶回收试剂盒回收DNA。

琼脂糖凝胶块在凝胶溶胶液中被迅速熔化并释放出DNA，DNA片断被选择性吸附到硅胶膜上，经DNA漂洗液洗涤去除残留在硅胶膜上的杂质和高浓度盐离子后，吸附到硅胶膜上的DNA片断经微量水或DNA洗脱液洗脱下来。该方法回收率高且不降解DNA，操作简单、快速、方便，纯化的DNA适合于任何分子生物学操作（如酶切、克隆、测序等）。

二、DNA胶回收试剂盒中各试剂的作用

1.溶胶液：溶解琼脂糖凝胶并保持DNA的稳定性。

溶胶液中通常含有Tris-HCl（提供一个温和的pH环境，保护DNA不被降解），EDTA（螯合金属离子如Mg2?和Ca2?，抑制核酸酶活性），SDS或Tween-20（溶解细胞膜和蛋白质，释放DNA），NaCl，β-巯基乙醇等。

2.漂洗液：去除杂质、盐类和其他不需要的物质，确保回收的DNA有较高的纯度。

漂洗液中通常含有乙醇（沉淀DNA、去除杂质），缓冲盐（维持pH），去污剂（除杂质），螯合剂（螯合金属离子）等。

3.洗脱液：溶解吸附在柱子上的DNA。

漂洗液中通常含有超纯水（溶解DNA），缓冲剂（维持pH），螯合剂（螯合金属离子）等。

三、DNA胶回收详细步骤

1.核酸电泳：琼脂糖凝胶电泳参照相关内容。

2.割胶：琼脂糖凝胶电泳后，用手术刀将目的DNA片段的琼脂块割下（尽量切除多余部分），称量琼脂块的重量。称量琼脂快的目的是为了确定溶胶液的体积。

3.添加溶胶液：将琼脂块放在离心管内用1mL枪头捣碎，加入3倍体积的溶胶液（如胶为100mg，则加300μL溶胶液），颠倒混匀，50-55℃水浴加热约10min至胶全熔。其间，需颠倒混匀三四次，以加速凝胶熔解。

胶溶时间的长短克根据胶碎片大小确定，确保全熔即可。

溶胶时，如果溶胶液变为红色（正常情况下为淡黄色），可向含有 DNA 的胶溶液中加入 10-30μL3M 醋酸钠（pH5.2）将胶溶液调为淡黄色，否则将会影响 DNA 与吸附柱的结合，影响回收效率。DNA在溶胶液中。

4.添加漂洗液：向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

这一步离心力一定要达到12000g，较低离心速度会导致DNA回收效率下降。DNA在吸附柱上。

5.添加漂洗液：向吸附柱中加入 600μL漂洗液，12000rpm 离心 1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

再次除杂质，提高DNA纯度。

6.干燥：12000rpm 离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱敞口置于室温或50℃培养箱中放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，防止漂洗液中的乙醇影响后续的实验。

残留乙醇可能会影响DNA的稳定性，影响转化效率、影响基因表达等。

7.添加洗脱液洗脱：将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加适量经 65℃水浴预热的洗脱液，室温放置 2min，12000rpm 离心 1min。

洗脱液预热可以提高DNA的洗脱效率，缩短洗脱时间，有助于提高DNA的回收质量和产量。8.收集储存DNA：将收集到的DNA洗脱液储存于-20℃或-80℃。四、试验技巧和注意事项

1.试验技巧

按部就班。目前市面上有很多厂家试剂盒，按照说明书一步一步操作，切勿张冠李戴，影响试验结果。

2.温度

溶胶温度、干燥温度、洗脱温度都要把控好，避免高温导致DNA变性或乙醇残留等。

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