UPLC-MS/MS快速筛查药用胶塞中12种抗氧剂
余秋玲*，张永梅，邱月，龙梅，秦瑶
(重庆市计量质量检测研究院，重庆 401123)
摘 要：建立了基于超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定药用胶塞中12种抗氧剂的分析方法。胶塞以20%乙醇为提取溶剂，60℃浸泡72 h，提取液经乙腈辅助盐析液液萃取后过0.22 μm PTFE滤膜，以甲醇-水（含5 mmol/L甲酸铵和0.02%甲酸）为流动相进行梯度洗脱，经Hypersil Gold C8 （100 × 2.1 mm，1.9 μm）色谱柱分离，ESI源正负离子切换模式下多反应监测（MRM）扫描，外标法定量。结果表明，在最优条件下，12种抗氧剂线性关系良好，平均加标回收率为75.6% ~ 117.1%，相对标准偏差（RSDs）为0.9% ~ 8.4%（n = 6），检出限（LODs）为0.1 ~ 25 ng/g。本方法前处理简单、准确度高、检出限低、分析时间短至6 min，可用于药用胶塞中12种抗氧剂可提取量的快速筛查。
关键词：抗氧剂；超高效液相色谱-串联质谱法；胶塞
Rapid Screening of 12 Antioxidants in Rubber Plugs by UPLC-MS/MS
YU Qiu-ling1*，ZHANG Yong-Mei1，Qiu Yue，Long Mei，Qin Yao
(Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection, Chongqing 401123, China)
Abstract：A method for determining 12 antioxidants in rubber plug by UPLC-MS/MS was established. The rubber plug was soaked in 20% ethanol for 72 h at 60℃. The extracting solution was extracted by by acetonitrile assisted salting-out liquid extraction, followed by clean-up through a 0.22 μm PTFE membrane. The separation was conducted on Hypersil Gold C8 chromatographic column (100 × 2.1 mm, 1.9 μm) with methanol-water (containing 5 mmol/L ammonium formate and 0.02% formic acid) as mobile phase. The target compounds were detected in turn under electrospray ionization (ESI) positive and negative ion multiple reactive monitoring (MRM) mode, and quantified by external standard method. The results showed that under the optimized conditions, the average recoveries were 75.6% ~ 117.1%, the RSDs were 0.9% ~ 8.4% (n = 6), and the LODs were 0.1 ~ 25 ng/g. This method shows the advantages of simple pretreatment, high accuracy, low detection limit and short analysis time (6 min), which can be used for the rapid screening of the extractable quantities of 12 antioxidants in medicinal rubber plugs.
Key words：antioxidants; UPLC-MS/MS; rubber plugs
胶塞是药品包装材料中重要的密封组件，具有弹性好、抗腐蚀性强等优点，为抑制或延缓其氧化[1]，需加入抗氧剂。药用胶塞主要用于西林瓶、预灌封注射器、笔帽式注射器等。绝大多数情况下，药品与胶塞直接接触，胶塞中的抗氧剂会迁移至药品中[2]，从而对患者的身体健康构成威胁。《弹性体密封件相容性试验指导原则（试行）》[3]明确指出热塑性弹性体在共混时一般都会加入抗氧剂，须在相容性研究试验中予以重点关注。因此建立药用胶塞中多种抗氧剂的检测方法十分必要。
目前抗氧剂的检测方法种类较多，主要有液相色谱法[4-5]、液相色谱-串联质谱法[6]、气相色谱质谱联用法[7-8]和超临界流体色谱法[9]等。其中，液相色谱法应用范围最广，但其存在检测时间较长、检出限较高的缺点；气相色谱质谱联用法无法对高沸点抗氧剂（如抗氧剂168等）进行分析，适用范围窄；超临界流体色谱法对仪器硬件要求较高，该技术未得到广泛应用[10]。液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）将质谱的高选择性、高灵敏度和液相色谱的高分离能力集中于一体，在现代分析领域中具有广泛的应用。胡佩[11]等采用高效液相色谱-串联质谱法同时检测药品包装中9种抗氧剂，但其分析时间长达30 min；董犇[12]等采用超高效液相色谱-串联质谱技术同时检测食品接触材料及制品中9种抗氧剂，分析时间约8 min，但其仪器检出限为0.1 mg/L，灵敏度相对较低。程畅[13]等采用液相色谱-串联质谱法检测食品接触橡胶密封垫圈中7种抗氧剂，分析时间约15 min。综上，目前报道的采用液相色谱串联质谱技术检测抗氧剂的方法普遍存在能同时检测的抗氧剂种类少、灵敏度较低或分析效率低等问题。
本研究基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术建立了药用胶塞中12种抗氧剂的检测方法，该方法前处理简单，灵敏度高，定性定量准确，可在6 min内实现12种抗氧剂的同时检测。为药品与包材相容性试验中抗氧剂的快速筛查提供了技术参考。
1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料
超高效液相色谱-串联质谱仪（美国AB SCIEX公司）；SQP型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；电热恒温培养箱（上海森信试验仪器有限公司）；Lab Dancer涡旋混合仪（德国IKA公司）。
抗氧剂1024（99.6%）、抗氧剂1035（98.0%）、抗氧剂1222（97.5%）、抗氧剂1425（98.4%）、抗氧剂300（95.0%）、抗氧剂702（98.7%）、抗氧剂BBM（99.8%）、抗氧剂168（99.8%）均购于广州佳途科技有限公司；抗氧剂3114（99.9%）购于美国Accustandard公司；抗氧剂BHT-COOH（98%）购于河北百灵威超精细材料有限公司；抗氧剂1310（99.4%）、抗氧剂330(99.5%)均购于北京曼哈格生物科技有限公司。以上12种抗氧剂的CAS号等信息见表1。乙腈（质谱级）、甲醇（质谱级）、甲酸（质谱级）均购于上海安谱实验科技股份有限公司；甲酸铵（质谱级）购于上海麦克林生化科技有限公司；乙醇（色谱纯）购于Fisher Chemical；二氯甲烷（色谱纯）购于霍尼韦尔贸易有限公司；氯化钠（分析纯）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）针式滤膜购于日本岛津公司。
表1 12种抗氧剂的序号、简称、化学文摘登记号、分子式和分子量
Table 1 Compound numbers, synonyms, CAS, molecular formulas and molecular weights of 12 antioxidants
No. | Compound | CAS No. | Formula | Molecular weight |
1 | AX 1425 | 65140-91-2 | C34H56CaO8P2 | 694.8 |
2 | AX BHT-COOH | 1421-49-4 | C15H22O3 | 250.3 |
3 | AX 1310 | 20170-32-5 | C17H26O3 | 278.4 |
4 | AX 1222 | 976-56-7 | C19H33O4P | 356.4 |
5 | AX 300 | 96-69-5 | C22H30O2S | 358.5 |
6 | AX 1024 | 32687-78-8 | C34H52N2O4 | 552.8 |
7 | AX BBM | 85-60-9 | C26H38O2 | 382.6 |
8 | AX 1035 | 41484-35-9 | C38H58O6S | 642.9 |
9 | AX 702 | 118-82-1 | C29H44O2 | 424.7 |
10 | AX 3114 | 27676-62-6 | C48H69N3O6 | 784.1 |
11 | AX 330 | 1709-70-2 | C54H78O3 | 775.2 |
12 | AX 168 | 31570-04-4 | C42H63O3P | 646.9 |
1.2 标准溶液的配制
分别精密称取各标准品25 mg（精确至0.1 mg），置于50 mL容量瓶中，加适量二氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准储备液。分别准确移取一定体积的标准储备液，用乙腈稀释成抗氧剂BBM和抗氧剂1310浓度为5000 ng/mL，抗氧剂168浓度为4000 ng/mL，抗氧剂3114浓度为2000 ng/mL，其余各物质浓度为1000 ng/mL的中间液。再用乙腈将上述中间液稀释成抗氧剂BBM和抗氧剂1310浓度为25、50、100、250、375、500 ng/mL，抗氧剂168浓度为20、40、80、200、300、400 ng/mL，抗氧剂3114浓度为10、20、40、100、150、200 ng/mL，其余各物质浓度为5、10、20、50、75、100 ng/mL的标准工作溶液。
1.3 样品前处理
将药用胶塞剪成小碎片（单个质量≤0.2g），称取20 g（精确至0.1 mg）置于带盖试剂瓶中，加入20%乙醇溶液100 mL，在60℃条件下浸泡72 h，冷却至室温，过滤即得胶塞的提取液。
准确移取2.0 mL提取液于10 mL比色管中，再加入2.0 mL乙腈，涡旋摇匀，加1.0 g氯化钠，充分涡旋振荡萃取，静置分层，取上层清液过0.22 μm PTFE滤膜，供UPLC-MS/MS分析。
1.4 仪器条件
1.4.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil Gold C8（100 × 2.1 mm，1.9 μm）；流动相：A为0.02%甲酸和5 mmol/L甲酸铵混合水溶液，B为甲醇；柱温为45℃；进样体积为3 μL；流速0.3 mL/min；梯度洗脱程序：0~0.2 min，70% B；0.2~2 min，70%~98% B；2~6 min，98% B；6~6.5 min，98% ~70% B；6.5~7.5 min，70% B。
1.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）；离子模式：正、负离子模式；扫描模式：MRM；气帘气：30 psi；离子源温度：500℃；喷雾气和辅助加热气：50 psi。12种目标化合物的母离子、子离子、碰撞能、离子模式和保留时间见表2。
表2 12种抗氧剂的母离子、子离子、去簇电压、碰撞能量、离子模式和保留时间
Table 2 Parent ions, daughter ions, declustering potential, collision energies, polarity and retention time of 12 antioxidants
Compound | Parent ion (m/z) | Daughter
ions (m/z) | Declustering
potential (V) | Collision
energy (V) | Polarity | Retention
time (min) |
AX 1425 | 327.2 | 299.2*, 78.9 | -140 | -35, -90 | Negative | 1.90 |
AX BHT-COOH | 249.1 | 205*, 189.2 | -120 | -30, -46 | Negative | 2.20 |
AX 1310 | 277.2 | 58.8*, 205.2 | -95 | -34, -30 | Negative | 2.44 |
AX 1222 | 357.3 | 301*, 272.9 | 120 | 23, 28 | Positive | 2.67 |
AX 300 | 357.2 | 193.9*, 179.1 | -160 | -46, -59 | Negative | 2.94 |
AX 1024 | 570.4 | 553.3*, 497.3 | 70 | 18, 24 | Positive | 3.01 |
AX BBM | 381.2 | 337.4*, 163 | -147 | -52, -42 | Negative | 3.25 |
AX 1035 | 660.3 | 249*, 193.1 | 70 | 43, 59 | Positive | 3.61 |
AX 702 | 442.1 | 219.1*, 163.3 | 65 | 24, 25 | Positive | 3.72 |
AX 3114 | 801.2 | 219.3*, 784.1 | 110 | 32, 32 | Positive | 3.90 |
AX 330 | 792.6 | 219.2*, 569.5 | 100 | 41, 45 | Positive | 4.76 |
AX 168 | 647.2 | 347.1*, 291.3 | 146 | 53, 60 | Positive | 5.80 |
注：*代表定量离子。
2 结果与讨论
2.1 色谱柱的选择
分别考察了XSelect HSS T3(150 × 2.1 mm, 3.5 μm)，ZORBAX Eclipse Plus C18(50 × 2.1 mm, 1.9 μm)和Hypersil Gold C8(100 × 2.1 mm, 1.9 μm)对12种抗氧剂分离效果的影响。结果表明，使用XSelect HSS T3时，极性较弱的抗氧剂330和抗氧剂168不出峰；使用ZORBAX Eclipse Plus C18时，抗氧剂168有色谱柱残留；使用Hypersil Gold C8色谱柱时，12种抗氧剂均能正常出峰，分离效果较好且无色谱柱残留。原因可能是XSelect HSS T3和ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱对弱极性化合物的保留较强，导致弱极性化合物难以被洗脱下来，而Hypersil Gold C8色谱柱固定相碳链更短，对弱极性化合物的保留较弱，因此更容易被洗脱下来，从而避免色谱柱残留，因此选择Hypersil Gold C8色谱柱进行分离，12种抗氧剂的总离子流图见图1。
图1 12种抗氧剂的总离子流图，各色谱峰序号和对应的化合物与表1相同
Fig. 1 TIC of 12 antioxidants, the peak number and name of each compound are the same as those in Table 1
2.2 流动相的优化
流动相是影响色谱峰峰形、分离度及峰面积的一个重要因素。由于抗氧剂BBM的母离子为加氨离子，为最大程度提高抗氧剂BBM的响应强度，在水相中加入5 mmol/L的甲酸铵；另一方面，为改善抗氧剂1310的峰形，将流动相调至酸性[5]，考察了甲酸浓度在0 ~0.08%范围内对抗氧剂1310峰形和抗氧剂BBM峰面积的影响（图2）。结果表明，不加入甲酸时，抗氧剂1310的峰展宽；随着甲酸浓度的增大，抗氧剂BBM的响应强度逐渐减小，因此选择甲酸浓度为0.02%。
图2 甲酸浓度对抗氧剂1310峰形（a）和抗氧剂BBM峰面积（b）的影响
Fig. 2 Effects of formic acid concentration on the peak shape of antioxidant 1310 (a) and the peak area of antioxidant BBM (b)
2.3 质谱条件的优化
采用流动注射泵连续进样方式，分别在ESI＋、ESI-模式下对12种抗氧剂的单标溶液（浓度约500 ng/mL）进行全扫描确定母离子；然后根据母离子分别对其子离子进行扫描，选取丰度最大的2个子离子，其中丰度较大的定为定量离子，另一个则为定性离子；最后进行去簇电压和碰撞能的优化。12种抗氧剂的最佳质谱参数见表2。
2.4 线性关系、检出限与定量限
按照“1.2”配制12种抗氧剂的系列标准工作溶液，在最优的条件下上机测试，以各抗氧剂的浓度为横坐标（x, mg/L），对应的定量离子峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，建立线性回归方程。选取阴性胶塞样品进行加标，按照“1.3”进行前处理后上机测试，分别以信噪比（S/N=3，10）确定各抗氧剂的方法检出限（LODs）和方法定量限（LOQs）。结果见表3，12种抗氧剂在各自浓度范围内线性良好，线性相关系数r2均大于0.995，LODs、LOQs分别为0.1～25 ng/g和0.25～75 ng/g。
表3 12种抗氧剂的线性方程、线性相关系数、线性范围、检出限和定量限
Table 3 Linear equation, Linear correlation, Linear range, LODs and LOQs of 12 antioxidants
Compound | Linear equation | r2 | Linear range
(ng/mL) | LODs
(ng/g) | LOQs
(ng/g) |
AX 1425 | y = 20 527.7x – 23 838.2 | 0.999 45 | 5 ~ 100 | 5 | 15 |
AX BHT-COOH | y = 10 951.9x – 4 890.5 | 0.999 02 | 5 ~ 100 | 1.5 | 4.5 |
AX 1310 | y = 2 846.3x – 12 967.3 | 0.999 25 | 25 ~ 500 | 25 | 75 |
AX 1222 | y = 165 284x + 37 745 | 0.999 57 | 5 ~ 100 | 0.1 | 0.25 |
AX 300 | y = 60 744.7x – 35 299.7 | 0.999 72 | 5 ~ 100 | 0.5 | 1.5 |
AX 1024 | y = 50 564.7x – 29 177.3 | 0.998 68 | 5 ~ 100 | 0.25 | 1 |
AX BBM | y = 614.7x – 8 343.2 | 0.997 63 | 25 ~ 500 | 3 | 7.5 |
AX 1035 | y = 30 837.3x – 92 695.6 | 0.997 65 | 5 ~ 100 | 0.15 | 0.3 |
AX 702 | y = 48 026.2x – 105 092 | 0.997 38 | 5 ~ 100 | 0.5 | 1.5 |
AX 3114 | y = 7 229.3x – 32 598.4 | 0.997 01 | 10 ~ 200 | 0.5 | 1.5 |
AX 330 | y = 147 329x + 92 685.8 | 0.998 66 | 5 ~ 100 | 0.25 | 1 |
AX 168 | y = 9 303.0 x + 31 754.9 | 0.998 60 | 20 ~ 400 | 1 | 2.5 |
2.5 回收率与标准偏差
选取阴性胶塞样品分别进行3个浓度水平的加标试验，每个浓度水平进行6次试验。结果见表4，12种抗氧剂的平均加标回收率范围为75.6% ~ 117.1%，相对标准偏差（RSDs）范围为0.9% ~ 8.4%，表明该方法具有良好的准确度与精密度，能满足实际检测要求。
表4 12种抗氧剂的加标回收率和相对标准偏差（n=6）
Table 4 Recoveries and RSDs (n=6) of 12 antioxidants
Compound | Spiked (mg/kg) | Average recovery (%) | RSDs (%) |
AX 1425 | 0.025, 0.25, 0.5 | 87.8, 95.3, 75.6 | 2.3, 1.3, 1.1 |
AX BHT-COOH | 0.025, 0.25, 0.5 | 108, 102.3, 82.3 | 6, 3.5, 2.7 |
AX 1310 | 0.125, 1.25, 2.5 | 101.3, 100.9, 84.8 | 5.8, 0.9, 3 |
AX 1222 | 0.025, 0.25, 0.5 | 100.2, 102.9, 79.9 | 3, 0.9, 1.1 |
AX 300 | 0.025, 0.25, 0.5 | 96.2, 102.5, 81.7 | 3.3, 1.8, 2.6 |
AX 1024 | 0.025, 0.25, 0.5 | 96.8, 93.2, 79.1 | 7, 1.7, 8.4 |
AX BBM | 0.125, 1.25, 2.5 | 76.1, 107.7, 99.5 | 7.5, 1.5, 1.6 |
AX 1035 | 0.025, 0.25, 0.5 | 100.4, 107, 87.3 | 6.6, 5.3, 5.1 |
AX 702 | 0.025, 0.25, 0.5 | 116.9, 117.1, 97.6 | 6, 1.7, 1.7 |
AX 3114 | 0.05, 0.5, 1.0 | 98.9, 107.1, 87.9 | 5.4, 4.5, 3.2 |
AX 330 | 0.025, 0.25, 0.5 | 114.5, 109.9, 81.7 | 3.7, 3.8, 2.6 |
AX 168 | 0.1, 1.0, 2.0 | 111.3, 106.8, 95.6 | 3.1, 1.5, 1.1 |
2.6 实际样品检测
采用本方法对10种市售药用胶塞中抗氧剂的可提取量进行筛查，结果表明，抗氧剂1310和抗氧剂BHT-COOH有检出，其余抗氧剂均未检出。其中，9种药用胶塞中检出抗氧剂1310，其可提取量为1.0~5.0 mg/kg，有3种药用胶塞中检出抗氧剂BHT-COOH，其可提取量为0.02~ 0.09 mg/kg。若药品采用上述阳性胶塞作为包装材料，则胶塞中抗氧剂1310或抗氧剂BHT-COOH存在向药品中迁移的风险，需在后续的迁移试验中进行监测。
3 结 论
本文通过对色谱柱、流动相和质谱条件的优化，建立了一种超高效液相色谱-串联质谱分析方法用于快速筛查药用胶塞中12种抗氧剂的可提取量。本方法前处理简单快速，灵敏度高，定性定量准确，为保证药品包装材料的安全使用提供了技术手段。
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