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【金秋计划】技巧与窍门:提高 LC-MS 的灵敏度
Ins_f12036f2
2024/09/11
私聊
实验室建设
引言
通过 HP
LC-MS
(高效
液相色谱
-质谱联用技术)进行任何高灵敏度分析的前提条件是:使用超纯溶剂和试剂,并谨慎处理所有相关材料、耗材和系统。这样就能在从制备到质谱检测的整个样品处理过程中防止任何污染,并提高灵敏度。
下文将介绍各种措施和方法,以最大限度地提高
LC-MS
灵敏度和低检测限 (LOD)。每一个小窍门都能避免造成信号抑制、加合物形成、背景噪声升高和谱图复杂性增加的污染。
溶剂和添加剂 - 概述
LC-MS
中使用的典型溶剂包括水、乙腈、甲醇、异丙醇和正丙醇。酸(如甲酸)、碱(如氨)或缓冲剂(如醋酸铵)等添加剂可用于使分析物质子化或去质子化。
上述溶剂和添加剂的质量对 MS 检测灵敏度有很大影响;因此,必须使用 MS 级溶剂和超纯添加剂。请确保这些试剂在生产商处标注为
LC-MS
级。
一般来说,用于 HPLC 的有机溶剂(如乙腈和甲醇)有三种质量:等度级、梯度级和用于
LC-MS
LiChrosolv® 的超纯级。对于 MS 分析,应使用超纯级质量溶剂,以确保最佳性能和可靠结果。
关于水,瓶装水或来自净水系统的 Milli-Q® 超纯水都适用于 MS 仪器。在用水量较低的情况下,最好使用瓶装水,而在用水量较高的环境下,则建议使用 Milli-Q® 水。Milli-Q® 系统提供 I 类水,与
LC-MS
分析完美匹配。应定期使用/冲洗,以保持甚至进一步改善水质。
缓冲液用于设置和控制特定色谱分离的 pH 值,并使溶液中的分析物质子化或去质子化,从而支持电喷雾电离过程。对于
LC-MS
,只能使用挥发性缓冲液和添加剂,如甲酸铵或乙酸铵或三乙胺。使用非挥发性缓冲液(如硫酸盐、磷酸盐、硼酸盐)会导致质谱源沉淀,最终导致繁琐的清洗程序。缓冲液浓度过高可能会导致信号抑制。
缓冲剂可使分析分子 M 电离,但有可能与铵、甲酸盐或醋酸盐等形成加合物,即[M+缓冲剂]。这会在质谱图中产生具有特定 m/z 值的额外信号,从而影响定量分析。因此,对于食物、体液或组织等高盐负荷样品,建议使用固相萃取 (SPE)(如 SupelTM-Select HLB 或 LiChrolut® 和 Supelclean® 滤芯)进行脱盐处理。
缓冲剂应通过滴定相应的酸和碱来制备,因为其纯度通常高于相关的盐。如果必须使用盐,则应在使用前对所使用的盐进行 MS 分析,以确定盐中是否存在污染物以及污染物的类型。
溶剂和添加剂中的杂质或污染物会积聚在固定相上,并在梯度运行中以鬼峰的形式洗脱出来(图 1)。当色谱柱在梯度运行前在高水性条件下进行平衡时,可能会出现这种情况。如果污染物的浓度和/或保留率较高,和/或梯度的起始条件为高水性,则甚至可能在未进行平衡的情况下出现鬼峰。为避免在梯度运行中出现鬼峰,应尽量缩短色谱柱平衡时间,冲洗体积不应超过十个色谱柱体积。
图 1. 高效
液相色谱
柱在平衡和梯度洗脱过程中污染物的累积情况;增塑剂峰用星号(*)标出。
仪器:Bruker Esquire 6000plus
流动相A:为水/乙腈 95/5 (v/v)+0.1%甲酸
流动相 B:乙腈+0.1%甲酸
梯度:0% B (t=0 min)--> 95% B (t=3 min)-->95% B (t=5 min)
流速:0.4 mL/min
柱温:25度
检测器:pos. ESI-MS (TICs)
样本:通过将塑料管浸入水性溶剂 A 而添加的增塑剂
应避免使用盐酸、硫酸或硝酸等强酸,因为它们容易与被分析物形成强离子对,从而使分析物不适合任何类型的电离。此外,其中一些强酸还具有不利的氧化特性。
许多实验室使用三氟乙酸(TFA)来与肽和蛋白质形成离子对,并改善后续的 HPLC 分离效果;然而,TFA 会在质谱检测过程中对分析物造成强烈的离子抑制,并可能污染质谱仪。如果必须使用反式脂肪酸,则应添加弱酸或异丙醇,以减少信号抑制效应。另外,二氟乙酸(DFA)也可降低信号抑制效应(与使用反式脂肪酸相比)。
溶剂和添加剂的储存和处理
溶剂应贮存在生产商提供的原装瓶中,可以是表面处理过的琥珀色玻璃瓶,也可以是硼硅玻璃瓶。建议根据具体需要调整瓶子的大小,因为应尽可能避免换瓶/转移到不同的容器中,以免造成污染。避免使用标准透明玻璃瓶或钠钙玻璃瓶。浸出碱和二氧化硅会与分析物形成加合物。
瓶子必须密封,并使用直接安装在溶剂瓶上的专业瓶盖、适配器和管道连接到 HPLC 系统。任何自制的溶液都可能造成溶剂或流动相的污染,并可能导致有机溶剂挥发到实验室的大气中。
避免使用塑料设备,如瓶子、漏斗、烧杯或手套,因为它们会溶解出增塑剂、抗静电剂、 稳定剂或防滑剂等添加剂(图 2)。唯一的例外是生产商已对可浸出物和可萃取物进行检测的设备,如
移液器
吸头或注射器。
图 2.分别储存在聚丙烯瓶(A)和干净的琥珀色玻璃瓶(B)中的两种
Milli-Q® 水样品的质谱图(下),以及相同样品的 TIC 图(上)。
分析是通过将溶剂直接注入以正 ESI 模式运行的质谱仪进行的。
实验室设备
实验室设备和容器的清洁最简单的方法是在通风橱中蒸发,因为 MS 应用中使用的所有试剂都是高纯度的挥发性试剂。在观察到污染的情况下,有必要使用 MS 级溶剂进行冲洗,以正确清洁设备。
如果出于某种原因需要使用洗碗机,则必须在清洗后用 MS 级溶剂多次冲洗器皿。
HPLC 色谱柱
选择高效
液相色谱
柱的尺寸不仅要考虑样品量、检测技术和必要的负载能力等因素,还要考虑经济因素,如减少溶剂消耗。减小色谱柱内径 (i.d.),同时相应调整进样量和流速,是提高特定分离灵敏度的简单方法。
在
LC-MS
运行中,色谱柱本身是一个可能且经常出现的污染源,但往往被忽视。许多硅胶键合相本身就容易因水解而导致键合/相裂解,主要是在酸性 pH 值(如 pH 值低于 2)时,这种现象被称为柱流失。
使用清洗方案有助于减少柱流失的负面影响。或者,在使用 MS 之前,色谱柱应进行多达十次从强水性到强有机性的梯度运行。
HPLC 系统
高效
液相色谱
系统本身的适当设置也有助于提高灵敏度。一个重要的参数是最大限度地减少死体积,即从进样器到检测器单元的所有系统部件的体积,但高效
液相色谱
柱的体积除外。过大的死体积会导致色谱峰变宽、拖尾或分裂,从而导致分离度变差、性能下降,进而降低灵敏度,无法检测到低含量的分析物。因此,所有系统部件(管路、接头、配件)的死体积都必须尽可能小。
每隔 1 至 2 个月或在溶剂从乙腈改为甲醇(或相反)后更换泵入口过滤器。这种维护可降低基线噪音,保护系统和色谱柱不受泵碎片的影响。
溶剂入口过滤器的流出物过滤网应使用不锈钢或 PEEK 材料,而不是玻璃。后者的清洁工作十分繁琐,因为缓冲残留物很难去除,而且硅和碱可能会从玻璃过滤器中浸出并形成加合物。
一般性建议
根据不同色谱问题的具体要求,可能需要使用从水性到有机的各种流动相成分。一般建议,
LC-MS
中使用的流动相的水相比例应设定在 5% 至 80% 之间,这样才能无故障地工作并获得稳定的喷雾。
如果水相比例低于 5%,缓冲液可能会在流动相液和 HPLC 系统中沉淀。对策是使用合适的有机溶剂或降低流动相中的缓冲液浓度。分析前应检查缓冲液在所用溶剂(和梯度范围)中的溶解度。
水相比例超过 80% 可能会导致质谱喷雾不稳定。有几种方法可帮助保持 MS 喷雾器正常工作。
在
液相色谱
系统之后、质谱源之前的流动相中加入乙腈或甲醇等挥发性有机溶剂,降低流动相的表面张力。
通过分流或柱交换减少输送到质谱仪的流量。
调节离子源条件(提高干气温度或流量)。
为避免系统和流动相受到微生物污染以及固定相塌陷,流动相的含水量不应超过 95%。如果需要高比例水相,可在流动相中加入 0.05% 的叠氮化钠。另外,在待机前必须定期用有机溶剂(最好是异丙醇或甲醇)冲洗 HPLC 系统。切勿使用乙腈,因为乙腈会聚合并堵塞系统阀门。
结论
质谱法是一种强大的技术,可用于鉴定和定量复杂混合物中的分子。质谱分析的成功在很大程度上取决于能否在整个
LC-MS
工作流程中减少污染:从样品制备到设备清洁。这一过程中重要的第一步就是为
LC-MS
专门使用最高质量的材料,包括溶剂、缓冲液、试剂和色谱柱。超纯溶剂和试剂与无污染处理相结合,确保了
LC-MS
灵敏度最大化和低 LODs
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