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【金秋计划】荷叶碱激活TFEB介导的自噬溶酶体通路改善肝脂肪变性和胰岛素抵抗

城头变幻大王骑

2024/09/12

中药/天然药检测

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的特征是肝脂肪变性和胰岛素抵抗，目前尚无批准的针对NAFLD的有效药物疗法。荷叶碱（Nuciferine）是一种含有生物碱的芳香环，是从荷叶中提取的主要活性成分，已被证明对代谢综合征具有广泛的药理活性，包括抗氧化剂，抗肥胖和抗炎作用。尽管现代药理学认为，荷叶碱能够改善肥胖及其相关的代谢紊乱性疾病，但荷叶碱改善NAFLD的作用靶点及发挥作用的分子机制并不清楚。

1、荷叶碱缓解HFD小鼠肝脏脂质积累、胰岛素抵抗、氧化应激和炎症反应

作者首先开展体内实验，荷叶碱处理显著减少HFD喂养的小鼠体重，增加肝脏重量和肝脏重量，减轻肝脂肪变性，降低空腹血中甘油三酯、葡萄糖和胰岛素的浓度，改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，缓解肝脏氧化应激和炎症反应。这些数据表明荷叶碱可缓解HFD小鼠的肝脏中的脂质积累，胰岛素抵抗，氧化应激和炎症。

2、荷叶碱激活NAFLD小鼠的肝自噬-溶酶体通路

作者通过转录组学分析确定荷叶碱对NAFLD的影响，发现受荷叶碱处理影响的基因富集在自噬、溶酶体和脂质代谢，并通过qRT-PCR得到验证，数据表明自噬-溶酶体通路（ALP）参与了荷叶碱治疗对NAFLD的有益作用。TFEB通过上调相关基因来控制自噬体和溶酶体生物发生，作者发现荷叶碱增强HFD小鼠中细胞核与胞质TFEB的比率，增加了TFEB的蛋白质丰度。此外，通过使用溶酶体蛋白酶抑制剂，作者发现荷叶碱增加了HFD小鼠中P62的降解和LC3-II的形成，表明荷叶碱增加了肝自噬通量。除自噬外，荷叶碱处理还增强了溶酶体功能，如溶酶体膜标志物LAMP1和CTSD丰度升高，以及溶酶体蛋白酶活性增加。这些数据表明，荷叶碱激活HFD小鼠肝脏中的TFEB和自噬-溶酶体通路。

3、荷叶碱通过TFEB激活自噬-溶酶体通路

作者进一步证实荷叶碱对TFEB和自噬-溶酶体通路活化的作用，发现荷叶碱增加TFEB的核定位，增强溶酶体功能。用荷叶碱和自噬通量抑制剂CQ处理的细胞检测P62和LC3-II丰度表明荷叶碱诱导自噬体形成和溶酶体降解。这些体外和体内结果进一步强调了荷叶碱对TFEB和自噬-溶酶体通路的激活作用。接着作者发现敲除TFEB消除了荷叶碱诱导的 P62降解、LC3-II 形成。此外，在饲喂HFD的肝细胞特异性TFEB敲除小鼠中，荷叶碱不显著影响肝自噬活性，也不影响溶酶体功能。这些结果表明荷叶碱对ALP的激活作用是由TFEB介导的。

4、敲除肝脏TFEB阻断荷叶碱对NAFLD的有益作用

作者进一步在体外敲低TFEB，发现抑制了荷叶碱对HepG2细胞中脂质积累、胰岛素抵抗、氧化应激和炎症反应的改善作用。此外，在肝细胞特异性TFEB敲除小鼠中，荷叶碱未能各种有益功效。这些数据表明，TFEB依赖性诱导自噬-溶酶体通路是荷叶碱介导的对NAFLD的有益作用的主要原因。

5、荷叶碱以mTORC1依赖性方式触发TFEB核易位

已有研究报道转录因子TFEB是自噬溶酶体通路的主要调节因子，被溶酶体表面的mTORC1磷酸化，使其保留在细胞质中并抑制其转录活性。Rags（RagC/RagD和RagA/RagB）和Ragulator（P18、P14、MP1、C7orf59、HBXIP组成）处于mTORC1上游可直接激活mTORC1并将mTORC1锚定在溶酶体。作者发现通过coIP实验发现荷叶碱抑制Rags和Ragulator相互作用，且抑制P14与P18、MP1、C7orf59、HBXIP之间的相互作用，表明荷叶碱通过损害Ragulator与Rags的相互作用来促进TFEB核定位，从而抑制其被mTORC1磷酸化。

6、荷叶碱与HBXIP互作破坏Rag-Ragulator相互作用并抑制mTORC1活性

据报道，TFEB的mTORC1依赖性磷酸化对Rags高度敏感。作者发现荷叶碱抑制Rags介导的mTORC1复合物溶酶体募集，抑制RagC与mTOR和TFEB的互作，并减少TFEB与RagA和RagC的互作，降低RagC的溶酶体定位，并减少了RagA，RagC，mTOR和TFEB的溶酶体定位。因此，荷叶碱通过减少Rags的溶酶体定位来抑制mTORC1活性。据报道，通过Ragulator复合物对Rags进行溶酶体锚定对于介导mTORC1溶酶体募集并因此激活是必要的。作者发现荷叶碱削弱了Rags和Ragulator之间的互作，以及RagC和P18之间的互作，以及P14与RagA和RagC之间的互作。此外，荷叶碱还降低了P14与P18、MP1、C7orf59和HBXIP的相互作用，表明荷叶碱也破坏了Ragulator复合物组分之间的互作。

接着作者检测荷叶碱是否与Ragulator复合物直接结合，从而改变复合物的正确组装和功能。研究人员通过CETSA证明荷叶碱与HBXIP直接结合，而非P14、P18、MP1 和 C7orf59，并通过分子对接发现荷叶碱与HBXIP的潜在结合口袋结合。这些数据表明，荷叶碱通过与HBXIP亚基相互作用，阻碍RagGTPases-Ragulator溶酶体支架的形成，抑制mTORC1活性。

总结

研究发现荷叶碱以TFEB依赖性方式激活自噬-溶酶体通路（ALP）并减轻脂肪变性。机理研究表明，荷叶碱与Ragulator的HBXIP亚基互作，并损害 Ragulator复合物与Rag GTP酶的相互作用，从而抑制mTORC1的溶酶体定位和活性，从而激活TFEB介导的自噬-溶酶体通路，并进一步改善肝脂肪变性和胰岛素抵抗。因此，荷叶碱是治疗NAFLD的候选药物，且调节mTORC1-TFEB-ALP轴是预防和治疗NAFLD病理结果的潜在有效策略。

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