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【金秋计划】基于转录组学和网络药理学探讨肉豆蔻挥发油干预低氧性肺动脉高压的作用机制

城头变幻大王骑

2024/09/13

中药/天然药检测

低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary artery hypertension，HPAH）是一种常见的肺血管疾病。该病的主要特征是低氧环境下肺血管收缩，持续低氧则导致肺动脉结构重塑，表现为肺动脉壁增厚，肺动脉血流阻力增加，引发右心负荷增重，严重时可发展为右心衰竭，甚至死亡[1]。HPAH多发于慢性阻塞性肺病、间质性肺病、睡眠呼吸暂停患者和长期暴露于高海拔地区的人群中[2]。HPAH的发生发展过程中，最关键的病理学变化是肺动脉血管的收缩和重构[3]。肺动脉血管中膜的主要成分为肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs），持续的血管张力和血压引起PASMCs增殖和肥大，是导致肺动脉高压发生发展的关键因素，严重可引起右心衰竭和死亡[4]。因此研究PASMCs增殖作用，探讨影响其增殖的调控通路是研究肺动脉高压治疗靶点的新方向。细胞周期信号通路是与细胞增殖周期相关的信号转导相关通路，为磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/ 蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、p53等通路的下游[4-5]。研究表明，下调细胞周期信号通路的相关蛋白，能够抑制PASMCs增殖和促进细胞凋亡，从而减轻肺血管重构和管壁增厚，缓解肺动脉高压症状[6-8]。
肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.的干燥种仁，广泛用于治疗腹泻、呕吐、宿食不消等症状，并具有抗炎、抗菌、抗氧化、镇痛、防癌、驱虫、降血糖和保肝等作用[9]。肉豆蔻的活性成分主要包括挥发油和木脂素类化合物[10]，然而这些成分在干预低氧性肺动脉高压过程中的作用和机制尚不明确。本课题组前期研究发现肉豆蔻挥发油（volatile oil from M. fragrans，VOMF）在高海拔低氧低压环境下具有抑制PASMCs增殖的作用，其主要作用机制可能与上调p27Kip1蛋白表达，从而抑制细胞周期蛋白D1（cell cycle protein D1，Cyclin D1）与细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin dependent kinase 4，CDK4）结合产物有关[11]。为进一步探究VOMF治疗HPAH可能存在的途径和靶点，本研究采用网络药理学和转录组学分析技术，探讨VOMF干预HPAH的作用机制，并结合Western blotting实验对转录组学和网络药理学结果进行验证，为VOMF的临床应用提供参考依据。
1 材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠8只，体质量（100±10）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2019-0010。动物饲养于温度（22±2）℃、相对湿度40%～60%的环境中，适应性饲养7 d，自由进食饮水。动物实验经青海大学伦理委员会批准（批准号2017081501）。
1.2 药材
肉豆蔻购自青海中藏药市场，经青海大学张得钧教授鉴定为肉豆蔻科植物肉豆蔻M. fragrans Houtt.的干燥种仁。VOMF的提取方法、主要化学成分及含量见课题组前期研究结果[11]。VOMF主要成分为单萜类和芳香族类化合物。利用GC-MS分析，共鉴定得到75个化合物。萜类化合物47种，占总挥发油的61.21%，其中单帖类30种（54.14%）、倍半萜类17种（7.07%）；脂肪族化合物14种，占总挥发油的6.74%，其中烷烃类2种（0.05%）、羧酸类3种（6.08%）、醇类3种（0.23%）、酯类4种（0.30%）、酮类2种（0.08%）；芳香族化合物14种，占总挥发油的32.52%，其中醚类5种（27.73%）、酚类8种（4.53%）、烃类1种（0.26%）。
1.3 药品与试剂
胎牛血清（批号2302008）购自上海达特希尔生物科技有限公司；双抗（批号SV30010）、二甲基亚砜（批号710N0317）、TritonX-100（批号304L024）购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM高糖基础培养基（批号WH0022U061）、无菌PBS缓冲液（批号WH0022E091）、0.25%胰蛋白酶溶液（批号WH0221K271）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；西地那非（批号139755-83-2）购自上海源叶生物科技有限公司；DAB染色试剂盒（批号17E10A27）、4%多聚甲醛（批号0810A22）、α-SMA抗体（批号BST17323902）、CDK2抗体（批号M00166-3）、CDK4抗体（批号PB9535）、Cyclin D1抗体（批号BM4272）、Cyclin A2抗体（批号PB9424）、p27Kip1抗体（批号A0290）、缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）抗体（批号PB9253）购自武汉博士德生物工程有限公司；β-actin抗体（批号AB0035）、山羊抗兔/鼠IgG二抗（批号AB0101）购自安必维技术有限公司。
1.4 仪器
51119770DP型全自动酶标仪、L550型高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；电热恒温水浴箱（北京市六一仪器厂）；HF212（HT）型常氧培养箱、HF100（Tri-Gas）型三气培养箱（上海力康公司）；DMi1型倒置光学显微镜（上海莱卡显微系统有限公司）；微孔板孵育振荡器（江苏其林贝尔仪器制造有限公司）；SW-CJ-1F型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；L550型离心机（湘仪实验室仪器开发有限公司）；Amersham Imager 600型显影仪（美国GE公司）；GWB-2T型超纯水机（普析通用仪器有限责任公司）。
2 方法
2.1 网络药理学分析
2.1.1 VOMF活性成分及对应靶点的筛选课题组前期通过GC-MS分析，共鉴定出VOMF中的75个化合物[11]，通过PubChem数据库（https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/）得到各成分的SMILES号，输入SwissTargetPrediction网站（http://www.swisstarget prediction.ch/）进行各成分的靶点预测，筛选可能性大于0筛选靶点，整理去重得VOMF成分靶点库。
2.1.2 肺动脉高压疾病靶点数据库的构建以“pulmonary artery hypertension，PAH”为关键词在GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）进行检索，来源选择“Homo sapiens”，系列类型选择“Expression profiling by array”，获取符合条件的数据集以构建肺动脉高压疾病靶点数据库。随后，使用R3.6.0（https://www.r-project.org/）中GEO query程序包对基因芯片数据进行下载，提取表达矩阵，对原始数据进行log2转化，并对数据进行归一化处理后提取临床信息。使用limma程序包对两组进行差异基因分析，界定条件为|log2差异倍数（fold change，FC）|＞0.585且校正后P＜0.05，绘制火山图和热图。
2.1.3 活性成分和疾病共同靶点的筛选通过Venny网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/Venn/）对VOMF的活性成分和肺动脉高压的靶点取交集，得到活性成分和疾病的交集靶点。
2.1.4 交集基因蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建和富集分析将上述筛选的核心基因导入String数据库（https://cn.string-db.org/），以“minimum required interaction score≥0.4”为筛选条件，构建PPI网络，下载并保存PPI网络和tsv格式文件。为了进一步探究交集基因的生物学功能，使用R软件中的“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”和“ggplot2”包对核心基因进行基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，探究VOMF潜在靶点的主要分子生物过程和信号通路，并进行可视化。
2.1.5 核心基因筛选及VOMF活性成分-靶点-疾病网络的构建为了进一步了解VOMF治疗肺动脉高压的潜在基因，对交集基因进行筛选分析核心基因。将核心基因导入string数据库后，保留tsv格式文件，将其导入Cytoscape软件。利用cytohubba插件进行核心基因的筛选。最后采用Cytoscape 3.9.0软件将结果进行可视化，构建“成分-靶点-疾病”网络图，通过其软件自带插件对网络展开分析，筛选其中度值较高的成分和靶点开展分子对接研究。
2.2 分子对接验证
将核心成分导入Chem3D软件中，构建其化学结构式并对其进行能量最小化处理，保存为pdb格式文件，将关键靶点带入PDB数据库中，下载对应蛋白为pdb格式文件，将其导入pymol软件中进行去除水分子，去除小分子，将蛋白导入autodocktool软件中进行加氢处理，并保存为pdbqt格式文件。利用pymol和MOE软件采用全原子对接方法进行分子对接和可视化分析。
2.3 体外实验验证
2.3.1 PASMCs的提取和培养将8～10周龄的SD大鼠脱颈处死，75%乙醇浸泡5～10 min，无菌快速分离大鼠肺组织，在无菌操作台上将肺组织放入培养皿中以PBS浸泡，置于冰上。分离肺组织2～3级肺血管，将肺小动脉血管剪开轻微刮除内层和外层后，置于含15 %胎牛血清-DMEM培养基的培养皿中，用眼科剪将2～3级肺血管剪成1～2 mm的组织块，转移到T25培养瓶中[12]。将T25培养瓶置于37 ℃、5% CO2恒温细胞培养箱中孵育，期间不进行移动，贴壁3～7 d，显微镜下观察组织块周围是否有细胞爬出，待细胞密度达约70%时，用0.25%胰酶消化并传代。用含15%胎牛血清的DMEM培养基培养大鼠原代PASMCs并传代。
取3代细胞进行α-SMA免疫组化实验，在6孔板中的玻片上以2.5×105个/孔接种，常氧培养至细胞融合度达50%时，每孔加入200 μL预冷的4%多聚甲醛，室温固定20 min，PBS清洗，加入200 μL 0.3% TritonX-100，10 min后加入3% H2O2，清洗后加入5%牛血清白蛋白，37 ℃封闭30 min，以1∶500比例加入PBS（阴性对照）和α-SMA（阳性对照），4 ℃孵育过夜，加入二抗，37 ℃孵育30 min，玻片上滴加DAB工作液，中性树胶封片后显微镜下观察阳性信号。
2.3.2 PASMCs的RNA提取、转录组学测序与数据分析取3代PASMCs用培养基稀释后，以3×105个/孔接种到6孔板中，培养24 h至贴壁后，去除培养液，加入无血清的培养基同步化处理细胞8 h，设置对照组、模型组及VOMF低、中、高剂量（0.8、1.6、3.2 g/L）组和西地那非（1.0 g/L）组，每组设置3个复孔，对照组常氧处理（5% CO2＋95%空气），其余各组低氧处理（3% O2＋5% CO2＋92% N2），各给药组给予药物培养24 h[13-14]。按照RNA提取试剂盒说明书对各组细胞进行RNA提取，每组3个复孔合并为1个样本。Ovation RNA-Seq System扩增cDNA，SPRI works Fragment Library System Ⅱ构建cDNA文库，将提取的RNA溶液委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行转录组学测序。以|log2FC|＞1、P＜0.05为条件筛选对照组vs模型组和模型组vs VOMF组的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），其中FC表示2个样品间表达量的比值，进一步取交集得到转录组学测序的DEGs。
2.3.3 Western blotting检测CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyclin A2、p27Kip1蛋白表达按“2.3.2”项下方法进行分组和给药，培养12 h，弃去培养液，用预冷PBS清洗3次。每孔加入细胞裂解液100 μL，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心5 min。取上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入上样缓冲液后煮沸5～10 min使蛋白变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶于室温封闭1 h后，分别加入兔抗β-actin（1∶10 000）、CDK2（1∶1 000）、CDK4（1∶1 000）、Cyclin D1（1∶1 000）、Cyclin A2（1∶1 000）、p27Kip1（1∶1 000）单克隆抗体，4 ℃摇床孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶10 000），室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min，加入ECL化学发光液曝光显色，采用Image J软件分析条带灰度值。
2.3.4 统计学分析数据采用表示，采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。t检验进行两组间比较，单因素方差分析进行多组间比较。
3 结果
3.1 网络药理学分析
3.1.1 VOMF活性成分靶点、疾病靶点以及交集靶点的筛选使用PubChem数据库获取VOMF活性成分相关SMILES号。随后，将SMILES号输入SwissTargetPrediction网站，进行成分的作用靶点预测，根据预测得分选取每个成分的靶点纳入成分靶点库中，同时删去预测得分为0的靶点并保留预测得分大于0的靶点进行汇总去重，最终整理得到VOMF活性成分相关靶点512个。
通过GEO数据库对肺动脉高压相关疾病靶点进行检索，作为发现的训练数据集，GSE113439数据集由GPL6244 [HuGene-1_0-st] Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array [transcript (gene) version]平台构建，包含15名肺动脉高压患者肺部组织样本和11名健康对照肺部组织样本，研究中使用的所有数据均由GEO获得。差异分析结果显示，共获得2 912个差异基因，包括2 076个上调的基因和836个下调的基因（图1）。将VOMF成分靶点与肺动脉高压靶点进行交集，得到二者共同靶点80个（图2）。
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3.1.2 成分-靶点-疾病网络的构建将活性成分和疾病靶点筛选得到的交集靶点导入到Cytoscape 3.9.0软件中，构建成分-交集靶点疾病网络（图3），活性成分、靶点以及疾病均以节点表示，相互关系则以边表示。随后，对疾病网络进行拓扑学分析，以度值反映节点的重要程度，度值越大则表示其在该网络中越重要。筛选出度值排名前10的主要活性成分为7,9-二叔丁基-1-氧杂螺[4.5]癸-6,9-二烯-2,8-二酮、异榄香脂素、乙酸香叶酯、肉豆蔻醚、榄香素、甲基异丁香酚、没药醇、邻苯二甲酸二丁酯、异丁香酚、α-桉叶油醇。
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3.1.3 交集靶点PPI网络构建和核心靶点筛选将上述80个交集靶点导入String数据库中，获取核心基因间相互作用关系图（图4）。为了进一步明确交集靶点在治疗肺动脉高压中的潜在机制，对交集靶点进行拓扑分析筛选核心靶点。通过Cytoscape软件中的cytohubba插件对80个交集靶点进行拓扑分析，根据其最大集团中心度、中介中心度、接近中心度、度值得分进行排序，最后将4种算法得到的前10位靶点进行交集，共获得5个核心靶点，分别是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，CASP3）、HIF1A、热休克蛋白90α家族A类成员1（heat shock protein 90α family class A member 1 gene，HSP90AA1）、Erb-b2受体酪氨酸激酶2（Erb-b2 receptor tyrosine kinase 2 gene，ERBB2）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）。
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3.1.4 富集分析通过R语言软件的“cluster profiler”包对VOMF治疗肺动脉高压的80个核心基因进行GO功能富集分析，结果得到GO条目共1651条（P＜0.05），主要类别为生物学进程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）。其中BP条目1 441个，主要涉及对药物的应答反应、对抗生素的应答反应、对脂多糖的应答、对细菌来源的分子的反应、节律程序等；CC条目79个，主要涉及转移酶复合体、转移含磷基团、膜筏、质膜微区、膜区、小腔等；MF条目131个，主要涉及胰岛素受体底物结合、支架蛋白结合、蛋白聚糖结合、内肽酶活性、组蛋白激酶活性等（图5）。表明VOMF可能通过作用于这些细胞结构，影响这些生物进程，发挥这些分子功能来达到治疗肺动脉高压的目的。
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通过R语言软件的“cluster profiler”包对VOMF治疗肺动脉高压的80个交集靶点进行KEGG通路富集分析，结果得到VOMF干预肺动脉高压的信号通路共140条（P＜0.05），主要涉及癌症中细胞程序性死亡配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）表达和细胞程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）检查点通路、C型凝集素受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、甲状腺激素信号通路、PI3K-Akt信号通路，将富集结果可视化，见图6。
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3.2 分子对接
选取5个核心靶点CASP3、HIF1A、HSP90AA1、ERBB2、PTGS2与前3个核心化合物7,9-二叔丁基-1-氧杂螺[4.5]癸-6,9-二烯-2,8-二酮、异榄香脂素、乙酸香叶酯进行分子对接，分子对接结合能热图见图7，分子对接模式见图8。乙酸香叶酯与PTGS2的结合能为?25.853 7 kJ/mol，具有较好的相互作用力，主要与LYS B:137形成氢键关联。7,9-二叔丁基-1-氧杂螺[4.5]癸-6,9-二烯-2,8-二酮与HSP90AA1结合能为?25.271 4 kJ/mol，具有良好的结合作用，主要与LYS A:58、ASN A:51形成氢键作用。乙酸香叶酯与HSP90AA1的结合能为?25.016 9 kJ/mol，具有良好的结合作用。7,9-二叔丁基-1-氧杂螺[4.5]癸-6,9-二烯-2,8-二酮与CASP3的结合能为?24.436 7 kJ/mol，具有良好的结合作用，主要形成氢键（GLN A:161）和疏水键作用力。
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3.3 体外验证实验
3.3.1 PASMCs验证利用α-SMA免疫组化法鉴别从SD大鼠肺中分离出的3代肺血管平滑肌细胞（图9）。染色结果呈棕黄色为阳性表达，且阳性信号超过98%。故细胞具有正常的α-SMA阳性表达，所得细胞为典型的PASMCs，可用于下一步实验。
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3.3.2 DEGs的筛选以|log2FC|＞1、P＜0.05为条件筛选DEGs，如图10所示，对照组vs模型组筛选后共得到228个DEGs，其中177个基因上调，51个基因下调。VOMF组vs模型组筛选后共得到398个DEGs，其中133个基因上调265个基因下调。将对照组vs模型组筛选到的228个DEGs和VOMF组vs模型组筛选得到的398个DEGs进一步取交集，得到40个共同DEGs。对40个共同DEGs进行聚类分析发现VOMF组与对照组基因表达量相似度低。
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3.3.3 GO功能和KEGG通路富集分析以P＜0.05为条件进行GO分析，对照组vs模型组筛选得到145个条目，其中大部分与能量代谢、糖酵解/异生相关，如二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）能量代谢、嘌呤核苷二磷酸代谢过程、糖酵解过程等BP；VOMF组vs模型组筛选得到176个条目，其中大部分与染色体分离、核分裂、细胞分裂等CC相关。以P＜0.05为条件进行KEGG通路富集分析，对照组vs模型组、VOMF组vs模型组筛选分别得到8条显著性信号通路，其中与HPAH密切相关的信号通路为细胞周期、HIF-1信号通路、MAPK信号通路，见图11。
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3.3.4 VOMF对低氧诱导的PASMCs中Cyclin D1、CDK4、p27Kip1、Cyclin A2、CDK2、HIF-1α蛋白表达的影响如图12所示，与对照组比较，模型组PASMCs中Cyclin D1、CDK4、Cyclin A2、CDK2、HIF-1α蛋白表达水平升高（P＜0.01、0.001），p27Kip1蛋白表达水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，VOMF各剂量组和西地那非组PASMCs中Cyclin A2蛋白表达水平降低（P＜0.05、0.01、0.001），VOMF中、高剂量组和西地那非组CDK4、CDK2蛋白表达水平降低（P＜0.05、0.01、0.001），VOMF中剂量组Cyclin D1蛋白表达水平降低（P＜0.01），VOMF低、中剂量组p27Kip1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01），各给药组HIF-1α蛋白表达水平均无明显差异。表明VOMF能够通过调控细胞周期相关蛋白改善低氧诱导的HPAH，从而抑制HPAH的发生发展。
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4 讨论
HPAH是肺动脉高压常见的临床类型，是由于低氧刺激或对高原低氧环境不习服所导致的恶性进展性疾病，低氧性肺血管收缩和肺血管重构是2个关键的病理性变化，急性缺氧可致肺血管收缩，慢性缺氧可致肺血管重构[15]。当机体处于急性低氧时，肺阻力性血管快速收缩，保障血流在传导性血管中重新分布，血流向供氧更好的区域，保证全身供氧，而肺动脉压力不至于过度升高。随低氧时间延长或慢性低氧状态下，在血管持续收缩的基础上，肺血管增殖过程启动[16]。缺氧时平滑肌细胞中产生并释放大量生物活性物质，这一变化导致血管平滑肌细胞收缩、离子通道功能改变、胞内Ca2+浓度升高及通道蛋白表达水平的变化，进而促进肺阻力血管收缩、肺动脉压力明显升高，PASMCs增殖[17]。HPAH通常伴有肺血管压力异常升高和右心衰竭等症状，其病因复杂，预后极差，其具体发病机制至今仍不明确，目前暂无有效的临床手段针对HPAH予以治疗。当前HPAH的传统治疗方法有吸氧、利尿剂、钙离子拮抗剂等，现有的靶向药物主要通过内皮素途径、前列环素途径及一氧化氮途径发挥疗效，这些途径的靶向药物可扩张血管、降低血管阻力，改善HPAH症状，但不良反应众多且严重，价格昂贵等因素限制了临床使用[18]，因此急需探寻新的靶向药物治疗HPAH。
VOMF是从肉豆蔻中提取的主要活性成分之一，在防病治病应用领域受到越来越多的关注。主要的研究集中在抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤的药理作用方面[19]。本课题组前期通过考察不同浓度的VOMF对低氧刺激下PASMCs增殖的抑制作用[11]，发现VOMF抑制低氧诱导的PASMCs增殖活性强于常氧组，且具有浓度相关性，主要的机制可能与Cyclin D1、CDK4等细胞周期相关蛋白的调控有关，表明VOMF能抑制血管中PASMCs增殖，从而降低肺血管阻力，舒张血管，延缓PAH的发生发展。
本研究通过RNA-seq测序技术将对照组vs模型组筛选到的228个DEGs和VOMF组vs模型组筛选得到的398个DEGs进一步取交集，得到40个共同DEGs。对40个共同DEGs进行聚类分析发现VOMF组与对照组基因表达量相似度低，这可能与样本量少有关。进一步对共同DEGs进行GO功能和KEGG通路富集分析，发现细胞周期信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路与VOMF干预HPAH的作用机制相关。结合文献调研和课题组前期研究后续选择细胞周期信号通路进行体外验证。Western blotting结果显示，VOMF能降低PASMCs中CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyclin A2蛋白表达，升高p27Kip1蛋白表达，提示VOMF可能通过调控细胞周期信号通路相关蛋白表达来干预HPAH。
CDKs和Cyclin是参与细胞周期调控的重要蛋白，在肺动脉高压的发生和发展中可能参与了细胞增殖、细胞凋亡和细胞迁移等重要过程[20]。CDKs是细胞内组成型表达的一种核内丝-苏氨酸蛋白激酶，单独存在无活性，由1个蛋白激酶和1个调节亚基组成，调节亚基被称为Cyclin[21]。在细胞分裂的G1阶段，CDK4和CDK6与Cyclin D结合，促进细胞进入S阶段[22]；在S阶段，CDK2与细胞周期蛋白E结合，推动DNA复制；在G2阶段，CDK1与细胞周期蛋白A和B结合，细胞准备进入有丝分裂[23]。也有研究认为Cyclin D1-MAPK通路能够抑制PASMCs的增殖，可能是通过MAPK及其磷酸化进一步调控Cyclin D1在细胞的表达[24]。Cyclin A2同样是在调节细胞周期和细胞分裂中起关键作用的蛋白质，与CDK2形成复合物，激活CDK2并使其磷酸化参与细胞周期进程的靶蛋白。这种细胞周期蛋白CDK复合物负责促进从G1期到S期以及从G2期到M期的转变[25-26]。本研究同时验证了VOMF会促使CDK2和Cyclin A2表达降低，提示CDK2和Cyclin A2可能改变细胞周期比例，最终减弱PASMCs增殖能力。Cui等[27]研究表明，PAH发生过程中PASMCs增殖作用使得Cyclin D1、CDK4活性增加，p27Kip1磷酸化水平降低从而下调p27Kip1，p27Kip1在细胞周期调控中具有重要作用，其蛋白表达下调与细胞异常增殖关系密切。这与课题组研究及本文结论基本一致。此外，本研究对HIF-1信号通路的蛋白进行了验证，但是VOMF组和模型组的相关蛋白表达没有差异，可能的原因是VOMF中的主要成分以单萜类和芳香族类化合物为主，对HIF-1信号通路敏感性较小有关。
综上，本研究基于课题组前期研究结果，即VOMF对低氧诱导的PASMCs增殖具有抑制作用，通过RNA-seq测序技术，发现与HPAH密切相关的信号通路为细胞周期信号通路。在HPAH发生时，细胞周期信号通路相关蛋白在促进肺血管收缩、PAECs功能障碍、PASMCs增殖、肺血管重构等方面发挥重要作用，可通过调控细胞周期相关蛋白发挥抗HPAH损伤的作用。

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