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【金秋计划】杜仲盐制前后胶丝力度与色度值及特征成分含量的相关性研究
城头变幻大王骑
2024/09/13
私聊
中药/天然药检测
杜仲为杜仲科杜仲属植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮,为我国名贵药材,在中医药方面的使用已有2 000多年的历史,《神农本草经》将其列为上品。杜仲具有补肝肾、强筋骨和安胎功效,用于治疗肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩、妊娠漏血和胎动不安等,目前常应用于临床的饮片主要为杜仲和盐杜仲[1]。杜仲经盐炙后,可缓和燥性、滋阴降火,增强补肝肾作用[2]。有文献报道,杜仲盐炙前后总氨基酸、总黄酮、总多糖以及京尼平苷、京尼平苷酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、阿魏醛、中脂素、松脂素、表松脂素等成分含量会有明显差异[3-4]。经课题组前期研究,发现京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷为杜仲盐炙前后主要差异特征成分[5]。杜仲胶是杜仲内存在的一种天然高分子材料[6],主要成分为反式聚异戊二烯[7],具有耐疲劳性能、粘接性能、物理机械性能等优点,其形态会随温度而改变[8-10]。杜仲炮制后杜仲胶的胶丝力度(F)产生显著变化,利用这一特性,《中国药典》将其作为盐杜仲炮制程度的判断依据之一,即要求“炒至断丝”。在生产实际中,盐杜仲在炒至断丝时,药典规定的指标成分松脂醇二葡萄糖苷往往达不到要求。饮片的颜色也是其炮制程度和饮片质量的判断依据之一[11-12],目前,大都是靠肉眼判断。近年来,机器视觉技术——电子眼(色度)在中药饮片质量方面的应用研究越来越多[13],可通过饮片的色度来客观地判断饮片炮制程度,为其质量评价研究提供参考[14-15]。因此,有必要考察杜仲胶的F与杜仲饮片颜色(色度)、特征成分之间的相关性,为判断炮制品的质量提供依据。
本实验针对杜仲饮片盐制前后杜仲胶的F、色度值L*、a*、b*、Eab*及京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的含量进行检测,分析盐制杜仲饮片F与外观颜色及其特征成分含量的相关性,为盐杜仲饮片的定性判别和质量控制提供科学依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Instron3343型材料试验机,美国英斯特朗公司;U3000型高效
液相色谱仪
,美国赛默飞世尔科技有限公司;CM-5型分光测色仪,日本柯尼卡美能达有限公司;ME-204E型电子分析天平(0.01 g)、XS105型电子分析天平(0.01 mg),瑞士梅特勒托利多公司;DFT-200型手提式高速万能粉碎机,温岭市林大机械有限公司;KQ-500DB型数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;DFD-700型电热恒温水浴锅,天津市泰斯特仪器有限公司;Canon EOS-50D型数码单反相机,佳能(中国)有限公司。
1.2 试样
对照品京尼平苷酸(批号111828-201805,质量分数为98.1%)、绿原酸(批号110753-201817,质量分数为96.8%)、金丝桃苷(批号111521-201809,质量分数为94.9%)、松脂醇二葡萄糖苷(批号111537-201706,质量分数为91.7%)、京尼平苷(批号110749-201919,质量分数为97.1%),均购自于中国食品药品检定研究院;对照品京尼平(批号21041202,质量分数99.40%)购自成都格利普生物科技有限公司。乙腈,色谱纯,美国Tedia公司;磷酸,分析纯,浙江汉诺化工科技有限公司;甲醇,分析纯,广东光华科技股份有限公司;纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司。
生杜仲饮片15批,编号为SP1~SP15,其中SP1~SP10为试验品,SP11~SP15为验证集,均购自浙江中医药大学中药饮片有限公司,由浙江中医药大学药学院葛卫红教授鉴定,为杜仲科杜仲属植物杜仲E. ulmoides Oliv.干燥树皮的加工品,样品均保存于浙江中医药大学中药饮片有限公司留样室。
2 方法与结果
2.1 样品的制备
盐杜仲饮片是由生杜仲饮片制备而来的延续性样品(炮制工艺:取生杜仲,加盐水,闷透,置炒制容器中,220 ℃加热炒制7~9 min,至丝易断、表面焦黑色,取出放凉,即得。每100千克杜仲,用食盐2 kg拌匀),编号为YP1~YP15,其中YP1~YP10为试验品,YP11~YP15为验证集。生杜仲饮片和盐杜仲饮片样品见图1。
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2.2 杜仲胶胶丝拉力测试
2.2.1 测试条件 将15批生品(SP1~SP15)和盐制品(YP1~YP15)均统一为长×宽×高=2.0 cm×2.0 cm×0.6 cm的规格,放入材料试验机中,测试位移速度30 mm/min,小位移0.5 mm拉断,再进行胶丝拉力测试。
2.2.2 胶丝拉力(F)结果 与生品相比,杜仲饮片盐制后F明显下降。表1结果显示,生杜仲饮片平均F均在5 N以上,盐杜仲饮片平均F均在5 N以下,明显区分为2类。对比盐制前后各批次样品F,YP1~YP15的F较炮制前均显著降低。提示杜仲饮片在盐制过程中F可能会呈现减弱的趋势。
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2.2.3 杜仲胶丝延展性分析 杜仲胶F的动态变化如图2所示,生杜仲饮片样品的F到达最高点后,其在24~25 s的F趋近于0;而在盐杜仲饮片样品中,F在14~15 s便趋近于0;说明盐杜仲饮片中杜仲胶F的下降时间短于生杜仲饮片,其胶丝延展性相较于生杜仲饮片差。
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2.2.4 聚类分析 将30个样品的F数据导入SPSS 26.0进行聚类分析,结果如图3所示,从中看出,生杜仲饮片与盐杜仲饮片样品可以较明显的分为2类,说明可根据F的不同来对杜仲饮片盐制前后样品进行区分判别。
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2.3 杜仲盐制前后色度定性判别模型的建立
2.3.1 色度检测方法 光源为D65脉冲氙灯,光源标准观察角度10°,目标孔径4 mm,测量波长范围为360~740 nm,重复性标准偏差ΔE在0.07以内,采用SCI反射光模式进行测定。取过三号筛的杜仲样品粉末适量,平铺于检测皿底部,重复测定色度3次,以均数为最终测定结果,得出明暗度(L*)、红绿色度(a*)、黄蓝色度(b*),同时通过公式计算总色度值[Eab*,Eab*=(a*2+a*2+a*2)1/2]。
2.3.2 精密度试验 取杜仲样品SP1粉末,装入测色皿中,均匀分布,按“2.3.1”项下色度检测方法进行样品颜色测定,连续测定6次,记录其L*、a*、b*值,计算Eab*值,得到各色度值的RSD分别为0.01%、0.09%、0.09%、0.01%,各指标的RSD值均≤1%,表明仪器精密度良好,符合实验要求。
2.3.3 重复性试验 取杜仲样品SP1粉末6份,装入测色皿中,均匀分布,按“2.3.1”项下色度检测方法进行6份样品颜色测定,记录其L*、a*、b*值,计算Eab*值,得到各色度值的RSD分别为0.26%、0.46%、0.65%、0.28%,各指标的RSD值均≤1%,表明方法重复性良好,符合实验要求。
2.3.4 稳定性试验 取杜仲样品SP1粉末,装入测色皿中,均匀分布,按“2.3.1”项下色度检测方法分别于0、2、4、6、8、10 h(将第1次的样品粉末均匀分布后开始测定,同时从当前时间开始计时)进行样品颜色测定,记录其L*、a*、b*值,计算Eab*值,得到各色度值的RSD分别为0.35%、0.96%、0.88%、0.36%,各指标的RSD值均≤1%,表明样品稳定性良好,符合实验要求。
2.3.5 样品色度测定结果 取杜仲生品(SP1~SP15)和盐制品(YP1~YP15)粉末,按“2.3.1”项下方法进行检测,记录其L*、a*、b*值,计算Eab*值。表2结果显示,杜仲生品L*、a*、b*、Eab*分别为51.27~53.06、5.69~6.10、11.78~13.10、52.95~54.99;盐制品L*、a*、b*、Eab*分别为48.00~49.61、4.98~5.64、9.88~11.44、49.30~51.10。杜仲饮片盐制后,其L*、a*、b*、Eab*均下降,这与炮制前后饮片由黄褐色变为焦黑色的颜色变化相符,表明盐制后杜仲饮片的L*、a*、b*、Eab*会发生不同程度的变化。
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2.3.6 色度定性判别模型的建立 将采集到的杜仲样品色度数据导入SIMCA 14.1软件进行处理。采用正交偏最小二乘-判别分析(orthogonal partial least squares-discrimination analysis,OPLS-DA)建立杜仲盐制过程色度定性判别模型,同时采用置换检验对模型进行验证,所得结果如图4、5所示,色度聚类趋势符合炮制变化的趋势。
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同时,通过验证集(SP11~S15、YP11~Y15)考察模型可靠性,结果表明模型稳定可靠。由图5置换检验可知,2条回归线斜率均较大,R2和Q2分别与左侧纵轴相交于(0,?0.032 8)和(0,?0.380 0),且左侧随机排列得到的R2和Q2均要小于右侧的原始值,说明原始模型的预测能力大于随机一次排列Y变量的预测能力,证明模型有效、可靠,且未出现过拟合现象。
2.4 杜仲盐制前后样品特征成分含量测定
2.4.1 样品的制备 杜仲盐制样品的制备同“2.1”项下方法进行。
2.4.2 供试品溶液的制备 取杜仲样品粉末(过三号筛)约2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,密塞,称定质量,超声处理(频率40 kHz、功率500 W)40 min,放冷,再称定质量,用50%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,精密量取25 mL续滤液于蒸发皿中,蒸干,用50%甲醇定容于5 mL量瓶中,离心后取上清液,即得供试品溶液。
2.4.3 混合对照品溶液的制备 取京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷对照品适量,精密称定,置于20 mL量瓶中,加50%甲醇制成质量浓度分别为3 207.87、477.22、1 029.00、299.19、1 061.89、112.93 μg/mL的混合对照品储备液,备用。
2.4.4 色谱条件 色谱柱为Waters HSS-T3柱(150 mm×2.1 mm,1.8 μm);流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B),梯度洗脱:0~20 min,2%~30% B;20~35 min,30%~50% B;35~42 min,50%~95% B;体积流量为0.3 mL/min;柱温为50 ℃;检测波长254 nm;进样量10 μL。
2.4.5 线性关系、检测限和定量限考察 量取适量对照品储备液,加50%甲醇溶液稀释定容,制备分别为原质量浓度1、1/4、1/6、1/8、1/16、1/32的混合对照品溶液,在上述色谱条件下,各质量浓度对照品溶液分别进样10 μL。以峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行线性回归,得回归方程:京尼平苷酸Y=0.112 0 X-8.802 5,R2=0.999 2,线性范围100.25~3 207.78 μg/mL;绿原酸Y=0.163 8 X+0.328 0,R2=0.999 8,线性范围14.91~477.22 μg/mL;京尼平苷Y=0.123 0 X-1.942 9,R2=0.999 3,线性范围32.16~1 029.00 μg/mL;京尼平Y=0.197 6 X+0.058 3,R2=0.999 7,线性范围9.35~299.19 μg/mL;松脂醇二葡萄糖苷Y=0.140 2 X-3.607 6,R2=0.999 4,线性范围33.18~1 061.88 μg/mL;金丝桃苷Y=0.233 3 X-0.084 8,R2=0.999 2,线性范围3.53~112.93 μg/mL。测定峰高为噪音3倍(S/N=3)时的进样质量浓度为检测限,测定峰高为噪音10倍(S/N=10)时的进样质量浓度为定量限,结果京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的检测限分别为0.26、0.01、0.10、0.11、0.16、0.04 μg/mL,定量限分别为0.88、0.04、0.32、0.36、0.53、0.12 μg/mL。
2.4.6 精密度试验 精密吸取同一批供试品溶液(SP1),按“2.4.4”项下色谱条件连续进样6次,结果显示京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷峰面积的RSD分别为0.36%、1.05%、0.26%、1.53%、0.12%、0.44%,各指标的RSD均≤2%,表明仪器精密度良好。
2.4.7 稳定性试验 取同一批供试品溶液(SP1),按“2.4.4”项下色谱条件,分别在制备后0、5、10、15、20、25 h进样,结果显示京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷峰面积的RSD分别为0.42%、0.95%、0.59%、0.40%、0.42%、0.30%,各指标的RSD均≤2%,结果表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定。
2.4.8 重复性试验 取同一样品(SP1),按“2.4.2”项下方法平行制备供试品溶液6份,按照“2.4.4”项下色谱条件进样,记录色谱图,结果显示京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷质量分数的RSD分别为0.30%、0.91%、1.79%、0.64%、0.55%、1.29%,各指标的RSD均≤2%,表明该方法重复性良好。
2.4.9 加样回收率试验 精密称取6份杜仲样品(SP1)各2.0 g,按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液,根据供试品中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的质量分数浓度,以1∶1的比例加入对照品,按“2.4.4”项下方法检测,并计算各成分含量与及其回收率。结果京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的平均加样回收率分别为99.08%、102.83%、100.48%、97.39%、97.27%、103.44%,RSD分别为1.22%、1.33%、1.29%、2.61%、2.10%、1.01%,RSD值均≤3%,说明方法准确度良好,符合实验要求。
2.4.10 样品测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL,注入高效
液相色谱仪
,得到各样品色谱图,提取峰面积数据,采用标准曲线法计算样品中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的质量分数,结果如表3与图6所示。
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2.4.11 成分权重分析 将采集到的杜仲样品含量数据导入SIMCA 14.1软件进行处理。采用OPLS-DA建立杜仲盐制前后含量定性判别模型,结果见图7-A,RX2=0.466,RY2=0.871,Q2=0.805,表示拟合的预测模型较可靠,盐制前后的杜仲成分含量能够较好地聚为2类。
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同时以变量重要性投影(variable importance projection,VIP)值≥1、|pcorr|≥0.5为条件,筛选对样本结果产生较大影响的化合物,对各成分权重配比,所得结果如图7-B、C,京尼平苷酸VIP值≥1且|pcorr|≥0.5,贡献最大,京尼平苷、绿原酸与金丝桃苷的|pcorr|≥0.5,贡献次之,而松脂醇二葡萄糖苷与京尼平VIP值<1且|pcorr|<0.5,贡献最低。因此,权重占比可设置为京尼平苷酸(35%)、京尼平苷(15%)、绿原酸(15%)、金丝桃苷(15%)、松脂醇二葡萄糖苷(10%)、京尼平(10%)。置换检验结果见图7-D,R2和Q2分别与左侧纵轴相交于(0,0.124)和(0,?0.405),且左侧随机排列得到的R2和Q2均要小于右侧的原始值,说明原始模型的预测能力大于随机一次排列Y变量的预测能力,证明模型有效、可靠,且未出现过拟合现象。
2.5 F与样品色度及特征成分含量相关性分析
2.5.1 皮尔逊双变量相关性分析 采用SPSS软件对样品F数据与色度值数据、特征成分含量数据进行皮尔逊双变量相关性分析,结果如表4所示,金丝桃苷的含量以及色度值L*、a*、b*、Eab*与F呈显著正相关,京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷的含量与F呈显著负相关,松脂醇二葡萄糖苷、京尼平的含量与F无显著相关性。
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2.5.2 偏最小二乘回归(partial least squares regression,PLSR)分析 利用SIMCA 14.1软件进行PLSR分析,首先以杜仲盐制前后6个成分含量作为自变量(X),以杜仲盐制前后的F均值作为因变量(Y1);其次,杜仲盐制前后的色度值L*、a*、b*、Eab*作为自变量(X),以杜仲盐制前后的F均值作为因变量(Y2),进行相关性分析,建立回归方程。结果如表5所示,因变量(Y1、Y2)的回归方程分别为Y1=?0.167 X1-0.167 X2-0.167 X3-0.167 X4+0.167 X5+0.167 X6,Y2=0.25X1+0.25 X2+0.25X3+0.25 X4。
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结果显示,杜仲盐制前后的胶丝力度均值与京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平的含量呈负相关,与松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的含量呈正相关;杜仲盐制前后的F均值与色度值L*、a*、b*、Eab*呈正相关。
3 讨论
杜仲在盐制时,断丝是其炮制经验鉴别、质量评价最常用的指标,然而传统人工经验的判定往往受主观因素的影响,缺乏客观、可量化的标准[16-17],要实现质量快速识别,则要求检测手段具有快速、无损、易于操作的优势。近年来,分光测色仪逐渐应用到中药颜色测定中[18-19],可以将光谱数据量化,快速测定饮片粉末、提取液的色度值,分析速度快,可实现在线分析,为中药炮制进行精确客观的质量控制提供技术支持[20-21]。
本研究利用材料试验机测定杜仲盐制前后样品的F变化,采用测色仪对盐制前后杜仲饮片色度值进行测定,发现杜仲饮片盐制后的F会显著降低,L*、a*、b*、Eab*也会不同程度的降低;采用HPLC法测定京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷、金丝桃苷的含量,发现杜仲盐制后金丝桃苷的含量降低,京尼平苷酸、绿原酸与京尼平苷的含量增加,松脂醇二葡萄糖苷和京尼平的含量无明显变化。同时,分析了杜仲盐制前后的成分权重,结果表明京尼平苷酸的贡献度最大,京尼平苷、绿原酸与金丝桃苷的贡献度稍次,松脂醇二葡萄糖苷与京尼平的贡献度最低。
在含量-色度-F相关性分析中,松脂醇二葡萄糖苷、京尼平的含量与F无显著相关性,与权重分析结果一致,这2个成分影响最小。此外,结合相关性分析与F-色度的PLSR分析,表明杜仲饮片F与色度值L*、a*、b*、Eab*均呈显著正相关。结合F-含量的PLSR分析结果表明,F与金丝桃苷的含量显著正相关,与京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷的含量显著负相关,但F、色度值、特征成分含量三者之间的具体联系有待后续实验进一步研究。
综上所述,本研究初步分析了杜仲盐制前后的F与含量及色度的相关性,为盐杜仲饮片的定性判别提供了科学依据,同时为杜仲盐制的质量控制提供了一种新的研究思路和理论基础。
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