定量pcr原理

定量聚合酶链式反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）是一种用于扩增和定量特定DNA片段的技术。qPCR不仅可以放大目标DNA序列的数量，还可以实时监测扩增过程中产物的累积情况，从而实现对起始模板DNA数量的精确量化。以下是定量PCR的基本原理和工作流程：

### 定量PCR的基本原理

#### 1. **DNA模板的扩增**
定量PCR的基本原理与传统的聚合酶链式反应（PCR）类似，都是通过循环加热和冷却来复制DNA片段。但与传统PCR不同的是，qPCR能够在每个循环中实时监测DNA扩增的情况。

#### 2. **实时监测**
在每个循环中，qPCR通过荧光标记来实时监测新合成的DNA链。荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比，因此可以通过测量荧光信号的变化来间接评估DNA模板的数量。

### 定量PCR的工作流程

#### 1. **反应体系准备**
- **引物设计**：设计一对特异性引物，使得它们能够与目标DNA序列的两端互补配对。
- **探针（可选）**：如果使用探针（如TaqMan探针），则需要设计一条能够与目标DNA序列中间区域互补的荧光标记探针。
- **反应混合物**：准备包含模板DNA、引物、dNTPs（脱氧核苷三磷酸）、缓冲液、镁离子以及热稳定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）在内的反应混合物。

#### 2. **PCR循环**
- **变性**：加热至约95?C，使双链DNA解旋为单链。
- **退火**：降低温度至约55-65?C，使引物与单链DNA模板结合。
- **延伸**：升温至约72?C，Taq DNA聚合酶沿引物延伸新的DNA链。

#### 3. **荧光信号检测**
- **荧光染料**：如果使用的是SYBR Green之类的荧光染料，它会在结合到双链DNA时发出荧光。
- **探针**：如果使用的是荧光探针（如TaqMan探针），则探针在被聚合酶切割时会释放荧光信号。
- **实时监测**：每次循环结束时，仪器会检测荧光信号强度，并记录下来。

#### 4. **数据分析**
- **阈值循环数（Ct值）**：Ct值指的是荧光信号达到预先设定阈值时所经历的循环次数。Ct值与起始模板量呈负相关关系。
- **相对定量**：通过比较目标基因与内参基因（通常是稳定表达的管家基因）的Ct值差异，可以计算目标基因的相对表达水平。
- **绝对定量**：如果使用标准曲线（Standard Curve），可以通过已知浓度的标准品绘制标准曲线，进而计算未知样本中目标DNA的绝对浓度。

### 定量PCR的应用
定量PCR广泛应用于分子生物学研究、临床诊断、疾病筛查、遗传学研究等领域，如病原微生物的检测、基因表达分析、SNP基因分型等。

定量PCR因其高灵敏度、特异性强、重复性好等优点，在科研和临床实践中有着不可替代的地位。