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超速离心法富集肿瘤来源的外泌体及其表征

小小矮马

2024/10/10
小矮马

液相色谱（LC）

超速离心法富集肿瘤来源的外泌体及其表征

　细胞培养

H1299和SW1271培养于10% FBS的DMEM培养基中，置于5% CO₂、37 ℃培养箱中生长。细胞培养过程中，及时通过显微镜观察细胞形态有无变化。2-3 d进行传代，取对数生长期细胞用于实验，收集细胞培养基上清液。

图为显微镜下观察培养的SW1271和H1299细胞形态。由图观察到SW1271细胞体积较小，突起较多，细胞边界不清晰，细胞核相对较大，具有特殊的形态学特点；由图观察到H1299细胞普遍大于SW1271，形状不规则，细胞核呈圆形或卵圆形。

图　SW1271显微镜下观察形态
图　H1299显微镜下观察形态

外泌体富集

利用超速离心法富集细胞上清液中的外泌体。如图2.1所示，用电动移液枪取细胞培养基上清液于离心管中，弃去细胞。500 g离心10 min去除上清液中的细胞，2000 g离心20 min去除上清液中的死细胞，10000 g离心40 min去除上清液中的细胞碎片。最后，0.22 μm滤膜过滤，得到细胞上清液。将细胞上清液放入超速离心管中，用无菌PBS配平，4 ℃下100, 000 g离心70 min。弃上清，PBS复溶沉淀，4 ℃下100, 000 g离心70 min。100 μL PBS重悬得到外泌体沉淀，-80 ℃保存。

图　超速离心法富集外泌体流程图

　BCA法测定蛋白质浓度

取0.8 mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20 mg BSA）中，充分溶解后配制成25 mg/mL的蛋白标准溶液。取适量25 mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为0.5 mg/mL。根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。将标准品加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μL，使标准品浓度分别为0.013、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL。加20 μL样品到96孔板的样品孔中。各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30分钟。用酶标仪测定562 nm波长的吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

蛋白浓度测定结果

BCA实验结果表明，SW1271肺癌细胞上清液中的外泌体的蛋白浓度为0.196 mg/mL，H1299肺癌细胞上清液中的外泌体的蛋白浓度为0.169 mg/mL。SW1271肺癌细胞上清液中的外泌体的蛋白浓度高于H1299细胞。这些差异可能与SW1271和H1299细胞之间的生物学特性、分子特征或激活状态有关。比如说，由于蛋白质装载或分选机制的差异，SW1271细胞可能比H1299细胞释放了更多的外泌体，或者SW1271外泌体中的蛋白含量更高；也可能是SW1271细胞具有特定的蛋白质亚群，这些蛋白质在SW1271细胞中表达或分泌得更多。

DLS法测外泌体粒径

DLS法测得外泌体粒径的步骤如下。首先是样品制备，通过超速离心法收集到外泌体样品，并稀释样品至适当的浓度；样品装载，将稀释的外泌体样品装入DLS比色皿中。确保样品中没有气泡；然后数据采集，启动DLS测量并采集散射光强度随时间的波动数据，测量时间通常为几分钟；最后数据分析，使用DLS软件分析散射光强度数据。

如图所示，H1299外泌体粒径峰值在101.44 nm处，SW1271外泌体粒径峰值在142.09 nm处，H1299细胞分泌的外泌体粒径普遍小于SW1271细胞分泌的外泌体。H1299为非小细胞肺癌细胞，SW1271为小细胞肺癌细胞，两者分泌的外泌体粒径不同可能是细胞类型不同造成的。除细胞类型不同外，两种细胞培养时所处的微环境不同，也可能造成外泌体粒径的不同。

图　DLS法测定SW1271外泌体粒径

　Western blot实验

Western blot实验操作如下。首先是样品制备，本实验设计的样品为：SW1271和H1299细胞上清液、超速离心SW1271和H1299细胞上清液后得到的外泌体、离心后的SW1271和H1299细胞上清液，实验前已使用BCA法定量蛋白质浓度，煮沸样品变性蛋白质；接下来是凝胶电泳，制备聚丙烯酰胺凝胶，将样品加载到凝胶上，进行电泳以根据分子量分离蛋白质；下一步电转移，将凝胶转移到PVDF膜上；封闭，用封闭缓冲液封闭膜，以阻断非特异性结合位点；一抗孵育，加入一抗静孵过夜；洗涤，用洗涤缓冲液洗涤膜，去除未结合的一抗；二抗孵育，加入二抗，让二抗与一抗结合；再次洗涤，用洗涤缓冲液再次洗涤膜，去除未结合的二抗；显色，加入显色底物，将膜暴露在成像仪上，以检测目标蛋白的信号；分析图像，以确定目标蛋白条带的位置和强度。

图为Western blot实验结果。如图所示，SW1271细胞仅在外泌体处有明显条带，细胞上清液和离心后的上清液没有明显条带。如图3.8所示，H1299细胞同样仅在外泌体处有明显条带，细胞上清液和离心后的上清液没有明显条带。以上结果说明，外泌体在超速离心后已被富集。

图SW1271外泌体特异性蛋白质CD9、HSC70、TSG101的Western blotting结果

图H1299外泌体特异性蛋白质CD9、HSC70、TSG101的Western blotting结果

外泌体蛋白质组学分析

运用质谱法进行蛋白质组学分析。实验步骤如下：将超速离心后得到的外泌体进行酵解。BCA法测蛋白浓度，100 μL SW1271测蛋白量为271.6 μg, 100 μL H1299测蛋白量为106.5 μg；取100 μL样品，加入200 μL 8M尿素，加6 μL 1M DTT（DTT终浓度20 mM），37 ℃水浴2小时，加2.22 mg IAA（IAA浓度40 mM），25 ℃避光震荡30分钟，加1.3 ML 0.1M碳酸氢铵。SW1271样品加入11 mg trpsin，H1299样品加入4.3 mg trpsin，37 ℃水浴16小时，二次加酶。酸化，样品加1% TFA，14000 g离心3分钟，10 mg除盐柱除盐。将样品送入质谱仪中进行分析，得到原始数据。

蛋白质差异表达分析

质谱分析结果表明SW1271细胞上清液富集的外泌体存在9236个蛋白，H1299细胞上清液富集的外泌体存在8517个蛋白。如图所示，SW1271和H1299细胞上清液中外泌体蛋白质两组经过蛋白质组测序富集到5867个共同表达蛋白H1299细胞上清液富集的外泌体中的特有蛋白有2650个，SW1271细胞上清液富集的外泌体中的特有蛋白有3369个。其中H1299与SW1271细胞上清液外泌体蛋白组相比，上调表达的蛋白有1379个，下调表达的蛋白有387个。通过进一步分析共同表达蛋白，有希望找到治疗肺癌的新靶点；通过分析H1299与SW1271的特有蛋白，有可能找到用于诊断小细胞肺癌和非小细胞肺癌的新靶点。

图　SW1271和H1299细胞上清液外泌体蛋白质组韦恩图

差异表达基因GO分析

将筛选出的差异表达蛋白基因进行GO分析，获得了生物过程、细胞组分和分子功能3个部分的结果。在生物学过程中，差异基因主要涉及对巨核细胞分化的负性调节、纤维蛋白溶解、端粒组织、细胞增殖、血液凝固、糖酵解过程、内肽酶活性的负调控。细胞组分的差异基因表达集中在核小体、细胞外空间、细胞外泌体、内质网腔、染色体端粒区、血小板α颗粒管腔、血液微粒。在分子功能方面，差异蛋白富集在内肽酶抑制剂活性、同种蛋白结合、RNA结合、ATP酶活性、粘连蛋白结合、肌动蛋白丝结合、细胞外基质结构成分、细胞骨架的结构成分、丝氨酸型内肽酶抑制剂活性。

差异表达基因覆盖细胞生命的全过程。在细胞生长方面，上调表达的基因可能包括促进能量产生和代谢的基因，而下调表达的基因可能包括抑制这些过程的基因，这些变化可能支持H1299细胞的快速生长和增殖。在细胞迁移方面，上调表达的基因可能含有促进细胞粘附和迁移的基因，而下调表达的基因可能包括抑制这些过程的基因，这些变化可能决定了细胞的转移。在免疫方面，上调表达的基因可能包括免疫抑制因子，而下调表达的基因可能包括免疫激活因子，这些变化可能有助于H1299细胞逃避免疫反应。这些基因的差异表达有助于探索在外泌体影响下的癌症细胞的生长过程，并研究出以外泌体为工具的小细胞肺癌、非小细胞肺癌临床诊断与治疗的新方法。

图差异基因GO分析

附件：

8 M 超速离心法富集肿瘤来源的外泌体及其表征.docx

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