Sil-AVI-ST色谱柱分离性能研究
仪器与试剂
表1 仪器设备
仪器名称 | 生产厂家 |
P230II型高压恒流泵
UV230II紫外-可见检测器 |
大连依利特分析仪器有限公司 |
GLK型装柱系统 |
无锡加莱克色谱科技有限公司 |
FTIR-850傅里叶变换红外光谱仪 |
天津港东科技股份有限公司 |
SB-100DT超声波清洗机 |
宁波新芝生物科技股份有限公司 |
RCT basic基本型数显加热磁力搅拌器 |
德国IKA公司 |
FA2004电子天平 |
上海舜宇恒平科学仪器有限公司 |
DZF-2B型真空干燥箱 |
北京市永光明医疗仪器有限公司 |
DZF-6020型真空干燥箱 |
上海博迅实业有限公司医疗设备厂 |
H2050R大容量高速台式冷冻离心机 |
湖南湘仪实验室仪器开发有限公司 |
实验试剂
实验试剂
| | 试剂名称 | 生产厂家 |
球形多孔硅胶 |
日本DAISOGEL公司 |
（3-巯丙基）三乙氧基硅烷（MPS）、2,2-偶氮二异丁腈（AIBN）、（3-氯苯基）硫脲、对氨基苯甲酰胺、萘、丙苯 |
上海阿拉丁生化科技股份有限公司 |
甲苯、三氯甲烷 |
天津市大茂化学试剂厂 |
甲醇、硫代乙酰胺、环己醇、异丙醇 |
天津市科密欧化学试剂有限公司 |
1-烯丙基-3-乙烯基咪唑溴盐（AVI）、巯基乙酸十八烷基酯（ST）、苯甲酰胺、苯、正丁基苯、乙酸铵 |
上海麦克林生化科技股份有限公司 |
乙腈 |
天津赛孚瑞科技有限公司 |
二乙基硫脲、亚乙基硫脲 |
上海泰坦科技股份有限公司阿达玛斯试剂 |
蒽 |
北京伊诺凯科技有限公司 |
色谱用超纯水 |
法国Millipore公司的Milli-Q系统纯化制备 |
实验内容
Sil-AVI-ST色谱固定相的制备
Sil-AVI-ST色谱固定相需经两步反应制备。
制备Sil-MPS的反应：称取2.0g提前干燥好的球形多孔硅胶置于150mL的双颈烧瓶中，加入溶剂甲苯45mL，再加入2mL的MPS，混合均匀，在氮气保护的条件下，于95℃加热，磁力搅拌反应24h后，待冷却至室温，先使用甲苯离心洗涤多次，再使用甲醇离心洗涤多次，洗涤后的产物置于80℃的烘箱中干燥24h，得到Sil-MPS。
制备Sil-AVI-ST的反应：称取2.0g提前干燥好的Sil-MPS置于150mL的双颈烧瓶中，加入3g的AVI和0.24g的AIBN，加入50mL的溶剂三氯甲烷，再加入0.6g的ST，混合均匀，在氮气保护的条件下，于60℃加热，磁力搅拌反应24h后，待冷却至室温，先使用三氯甲烷离心洗涤多次，再使用甲醇离心洗涤多次，洗涤后的产物置于80℃的烘箱中干燥24h，最终得到Sil-AVI-ST。
Sil-AVI-ST色谱柱填充
通过高压匀浆法将Sil-AVI-ST填充到空不锈钢柱（150mm×4.6mm）中：以环己醇-三氯甲烷（1:1，v/v）为匀浆液，称取2g的Sil-AVI-ST与匀浆液混合，超声处理使其分散均匀，将其倒入连接好空不锈钢柱的匀浆罐中，以甲醇-异丙醇（1:1，v/v）为加压液，缓慢调节装柱机压力至35MPa并保持30 min，装填结束后缓慢调节装柱机压力降至0MPa并静置30min，卸下色谱柱并组装柱头和筛板，用乙腈冲洗使其活化，备用。
结果与讨论
Sil-AVI-ST色谱固定相的表征
使用傅里叶变换红外光谱仪测定Sil-AVI-ST在4000-500cm-1范围内的红外吸收以对其进行表征，结果如图1所示。Sil-AVI-ST色谱固定相在3400cm-1的Si-OH拉伸振动峰减弱，表明一些硅醇基团与硅烷偶联试剂发生了反应，在2930cm-1和2860cm-1处的峰为-CH3和-CH2的拉伸振动特征吸收，1550 cm-1处的峰符合咪唑基团双键的拉伸振动特征峰[31,32]，以上特征吸收可以证明Sil-AVI-ST色谱固定相的成功制备。
图1 Sil-AVI-ST的红外光谱图
Sil-AVI-ST色谱柱分离硫脲类物质
选取二乙基硫脲、亚乙基硫脲和（3-氯苯基）硫脲三种亲水性硫脲类物质对Sil-AVI-ST色谱柱的分离性能进行考察。如图3-2所示，以乙腈/水（99:1，v/v）为流动相，二乙基硫脲的保留时间为2.29833min，亚乙基硫脲的保留时间为2.58750min，（3-氯苯基）硫脲的保留时间为2.95917min，三种硫脲类物质的洗脱顺序与亲水性顺序相符，且在4min内可实现基线分离，分离度分别为2.92和3.03，峰型良好，表现出令人满意的选择性和分离效率。
图硫脲类物质在Sil-AVI-ST色谱柱中的分离谱图
Sil-AVI-ST色谱柱分离酰胺类物质
选择硫代乙酰胺、苯甲酰胺和对氨基苯甲酰胺三种亲水性酰胺类物质对Sil-AVI-ST色谱柱的分离能力进行考察。如图3所示，以乙腈/水（99:1，v/v）为流动相，硫代乙酰胺的保留时间为2.38000min，苯甲酰胺的保留时间为2.93083min，对氨基苯甲酰胺的保留时间为4.35083min，且在5min内可实现基线分离，分离度分别为5.40和9.20，峰型良好，表现出令人满意的选择性和分离效率。三种酰胺类物质的洗脱顺序与亲水性顺序不完全相符，可能是由于Sil-AVI-ST固定相能提供多种保留机制，除了亲水相互作用外，固定相表面键合的AVI和ST提供的额外的疏水、氢键、π-π和静电相互作用，因此改变了分析物的洗脱顺序。
图3酰胺类物质在Sil-AVI-ST色谱柱中的分离谱图
Sil-AVI-ST色谱柱分离烷基苯类物质
选取甲苯、丙苯和丁苯三种疏水性烷基苯类物质对Sil-AVI-ST色谱柱的分离性能进行考察。如图4所示，以乙腈/水（30:70，v/v）为流动相，甲苯的保留时间为2.45667min，丙苯的保留时间为2.76250min，丁苯的保留时间为3.07417min，三种烷基苯类物质的洗脱顺序与极性顺序一致，且在4min内可实现基线分离，分离度分别为2.22和1.80，峰型良好，证明Sil-AVI-ST具有在富水条件下有效分离疏水类分析物的能力。
图4 烷基苯类物质在Sil-AVI-ST色谱柱中的分离谱图
Sil-AVI-ST色谱柱分离芳香类物质
选择苯、萘和蒽三种疏水性芳香类物质对Sil-AVI-ST色谱柱的分离性能进行考察。如图5所示，以乙腈/水（20:80，v/v）为流动相，苯的保留时间为2.49083min，萘的保留时间为3.16417min，蒽的保留时间为6.33988min，三种芳香类物质的洗脱顺序与极性顺序一致，可实现基线分离。蒽的色谱峰有严重的拖尾现象，这可能是疏水长链烷基在反相模式下对弱极性分析物的强吸附作用导致的，除了疏水作用以外，咪唑阳离子与芳香环之间的π-π相互作用也增强了芳香类分析物的保留，多种相互作用机制导致色谱峰有一定的拖尾现象。
图5 芳香类物质在Sil-AVI-ST色谱柱中的分离谱图
结论
本文在采用自由基介导的巯基键合反应合成一种新型咪唑类离子液体嵌入巯基硬脂酸功能化色谱固定相，并对其分离性能进行考察。
首先制备巯丙基化硅球（Sil-MPS），随后通过自由基介导的巯基键合反应将AVI键合到Sil-MPS表面，并与巯基乙酸十八烷基酯（ST）进一步反应以提高疏水选择性，获得新型咪唑类离子液体嵌入巯基硬脂酸功能化色谱固定相（Sil-AVI-ST），采用傅里叶变换红外光谱表征可证明其制备成功。将制备的Sil-AVI-ST色谱固定相用于各种分析物的分离，以对其分离能力进行考察。Sil-AVI-ST固定相达到了预期的分离效果，可以在亲水模式下分离亲水性的硫脲类和酰胺类物质，也可以在反相模式下分离疏水性的烷基苯类和芳香类物质。
实验结果表明，Sil-AVI-ST色谱柱具有多种类型的分离机制，这有利于在单个色谱柱上高效地分离多种类型的化合物。嵌入极性配体AVI可以提高长链烷基固定相对亲水分析物的分离效率，且Sil-AVI-ST色谱柱可以实现在富水条件下对疏水分析物的分离，这一点在一定程度上克服了传统反相色谱固定相的缺点。因此新制备的Sil-AVI-ST固定相具有良好的实际应用潜力。
本课题通过开发新的混合模式色谱固定相，为解决传统色谱固定相的缺陷、寻找在单柱上高效分离多种类型混合物的方法，提供了研究思路。
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