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高效液相色谱技能篇|关于分析方法建立的一般步骤的小知识
p3203140
2024/10/15
私聊
液相色谱(LC)
分析方法是指用于识别、测量和评估物质成分及其性质的一系列系统化技术手段和程序。一般我们通过以下几个步骤对方法进行初步的建立:
1.样品组成和分离目标的评估(可通过文献查找);
2.样品的预处理(根据方法目的评估);
3.色谱模式的选择(根据样品属性评估);
4.流动相的选择(根据色谱模式来评估)
5.检测器的选择(根据样品属性评估);
6.分离条件的选择(根据分离效果进行调整);
7.方法的初步确认,潜在问题的预估,识别和解决之道(通过确认发现问题);
8.方法确证和系统适应标准的确定(经过验证,明确方法)。
这其中的一些步骤并不是必需的,或者它们不需要我们花太多的精力。但复杂的样品和(或)要求很高的分析程序可能会超出简单重复上面所罗列的步骤的范畴,也就是说,在方法建立过程中出现特殊问题的时候,需要有一个逻辑的对策,以色谱操作员之前的经验和对文献记录的接触或熟悉程度为基础。
01.样品组成和分离目标的评估
在方法建之初,应该对样品的化学组成有一定的掌握。
如果样品中有酸性或者碱性的化合物,那就有必要在流动相里加入缓冲液来控制流动相的pH; 样品化合物的pKa值,如果知道的话,对方法建立都会非常有帮助。样品的分子量也有可能影响起始实验分离条件的选择。
如果你在文献资料查阅的过程中,有发现前人做过的方法,可以拿来借鉴并改良。
如果该产品与自家的其他产品类似,可先采用自家的平台方法进行摸索。
02.样品的预处理
在样品进样之前可能需要对样品做一些处理以便能除去那些可能会损害柱子或者干扰目标的化合物成分。
一般来说主要有以下几个方面:
1)
样品溶解:
确保样品完全溶解在适当的溶剂中,以避免在色谱柱上发生沉淀或吸附。
2)
样品净化:
去除样品中的杂质或干扰物,如蛋白质、脂质、糖、盐等,这些物质可能会干扰色谱分析或损坏色谱柱。
3)
样品浓缩:
对于低浓度样品,可能需要通过蒸发或固相萃取等技术进行浓缩,以提高检测灵敏度。
4)
样品提取:
使用适当的溶剂或提取技术(如液-液提取、固相萃取、固相微萃取等)从复杂样品基质中提取目标分析物。
5)
样品衍生化:
某些分析物可能需要通过化学反应转化为更适合色谱分析的形式,如增加或改变极性、增强紫外吸收或提高检测灵敏度。
6)
样品过滤:
通过过滤或离心去除样品中的颗粒物,以防止堵塞色谱柱。
7)
样品pH调节:
根据分析物的化学性质和色谱系统的要求,可能需要调节样品的pH值。
03.色谱模式的选择
反相色谱法是HPLC方法建交的一个默认选择。但是,取决于样品本身,其他的色谱模式也许会更合适。通常要等到初始的使用反相色谱法(RPC) 的实验无法成功的时候,使用其他色谱模式的需求才会变得更加明显。同理,如果样品中有异构体化合物,而且难以被反相色谱分离,那么使用以无键合的硅胶填充的色谱柱的正相色谱法(NPC)可能会更加容易获得成功。
1)
反相色谱(Reverse Phase, RP-HPLC):
最常用的色谱模式,适用于大多数小分子分析。
固定相通常是疏水性较强的C18或C8键合硅胶。
流动相为含水相(如水或缓冲溶液)和有机溶剂(如甲醇、乙腈)的混合物。
适用于分离非极性到中等极性的化合物。
2)
正相色谱(Normal Phase, NP-HPLC):
固定相是极性硅胶或氧化铝。
流动相为非极性或弱极性溶剂,如正己烷、异丙醇等。
适用于分离极性化合物,如多糖、极性代谢物等。
3)
亲水色谱(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC):
固定相是极性较强的键合硅胶。
流动相是含一定比例水的有机溶剂。
适用于分析极性化合物,如糖、极性代谢物。
4)
离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography, IEC):
固定相具有离子化功能基团,如磺酸基或季铵基。
通过离子相互作用分离带电化合物。
适用于分析离子型化合物,如氨基酸、核苷酸等。
5)
体积排阻色谱(Size Exclusion Chromatography, SEC):
固定相是多孔材料,根据分子大小进行分离。
流动相通常是单一溶剂或混合溶剂。
适用于大分子化合物的分子量分布分析。
6)
亲和色谱(Affinity Chromatography):
固定相具有与目标分子特异结合的特性。
适用于生物大分子的分离,如蛋白质、酶等。
04.流动相的选择
流动相是携带样品通过色谱柱的液体或气体,其组成、纯度和性质对色谱图的分离度、峰形、保留时间等关键参数起着决定性作用。以下是流动相选择时需要考虑的一些关键因素:
1)
溶剂的极性:
流动相的极性应与样品的极性相匹配,以确保有效的分离。极性溶剂适用于极性样品,而非极性溶剂适用于非极性样品。
2)
溶剂的纯度
:
高纯度的溶剂对于避免色谱图中出现额外的峰和背景噪音至关重要。
3)
溶剂的粘度:
低粘度的溶剂可以提高色谱柱的效率和缩短分析时间。
4)
溶剂的化学稳定性:
流动相应具有良好的化学稳定性,以避免在色谱过程中发生分解或反应。
5)
溶剂的挥发性:
对于需要使用质谱检测器的分析,应选择挥发性较好的溶剂,以减少离子源的污染。
6)
溶剂的毒性和安全性:
应考虑溶剂的毒性和操作安全性,优先选择无毒或低毒的溶剂。
7)
溶剂的兼容性:
流动相应与检测器兼容,例如,某些溶剂可能不适用于某些类型的检测器。
针对上述分离模式的流动相选择,一般如下:
1)反相色谱(RP-HPLC):
常用有机溶剂如乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)、异丙醇(IPA)等。
水作为强溶剂,常与有机溶剂混合使用,可通过调节pH值和添加缓冲液来优化分离。
2)正相色谱(NP-HPLC):
常用非极性或弱极性溶剂,如正己烷、异辛烷、苯和二甲苯等。
极性溶剂如四氢呋喃(THF)或乙酸乙酯可用作修饰剂。
3)亲水色谱(HILIC):
流动相通常由水和有机溶剂(如乙腈)组成,水作为强溶剂。
可通过增加有机溶剂比例来降低保留度。
4)离子交换色谱(IEC):
常用水相缓冲液,如磷酸盐、醋酸盐、硼酸盐等。
可添加有机溶剂如甲醇或乙腈以增强洗脱能力。
5)体积排阻色谱(SEC):
常用水相缓冲液,如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液等,常与氯化钠等盐类配合使用。
对于特定生物分子,可使用乙腈、甲醇等有机溶剂。
6)亲和色谱(AC):
流动相的选择取决于特定的生物分子和配体,通常使用与生物分子相容的缓冲溶液。
05.检测器的选择
检测器的选择取决于样品的特性、分析的目标以及所需的灵敏度和选择性。以下是一些常用的HPLC检测器及其选择的依据:
1)
紫外-可见光(UV-Vis)检测器:
适用于具有紫外-可见光吸收的化合物。
灵敏度较高,但流动相的选择受到限制,不能使用具有紫外吸收的溶剂。
光电二极管阵列检测器(DAD)
可以提供额外的光谱信息,有助于化合物的鉴定。
2)
荧光检测器(FD):
高灵敏度和选择性,适用于能产生荧光的化合物。
适用于痕量分析,但需要样品具有或能衍生成荧光性质。
3)
示差折光检测器(RID):
通用型检测器,适用于所有溶质,特别是无紫外吸收的化合物。
受温度和流动相组成变化的影响较大,不适合梯度洗脱。
4)
电化学检测器(ED):
适用于具有电活性的化合物,如某些无机离子和有机化合物。
灵敏度高,但易受样品中杂质和氧气的影响。
5)
蒸发光散射检测器(ELSD):
通用型检测器,适用于无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物。
灵敏度比RID高,对温度变化不敏感,基线稳定,适合与梯度洗脱
液相色谱
联用。
不受样品光学特性的影响,对流动相的选择限制较少。
6)
电喷雾检测器(CAD):
通用型检测器,适用于无紫外吸收化合物,如碳水化合物、脂类和聚合物。
灵敏度高,重现性好。适合非挥发性和半挥发性有机物的定量或半定量分析。
7)
化学发光检测器(CD):
适用于需要通过化学反应产生光信号的化合物。
8)
质谱检测器(MSD):
提供高灵敏度和选择性,同时给出化合物的质谱信息,有助于结构鉴定。
适用于复杂样品中目标化合物的定性和定量分析。
06.分离条件的选择
在知道样品的特性,色谱的模式、流动相的选择以及检测器的确定后,即可对方法进行的初步分离筛选:
1)
色谱柱的选择:
色谱柱的选择取决于样品的性质和分析目标。常见的色谱柱包括反相色谱柱(如C18)、正相色谱柱(如硅胶)、亲水作用色谱柱(HILIC)、离子交换色谱柱等。
2)
流速:
流速影响样品通过色谱柱的速度,进而影响保留时间和分离度。流速的选择需要平衡分析时间与分离效率。
3)
柱温:
柱温会影响样品的保留行为和色谱柱的效率。在某些情况下,提高柱温可以改善分离效果,但也可能增加样品的降解风险。
4)
梯度洗脱:
在复杂的样品分析中,梯度洗脱可以通过程序化改变流动相组成来优化分离。梯度洗脱可以提高分离效率和缩短分析时间。
5)
等度洗脱:
适用于简单的样品分离。
6)
样品上样量:
样品上样量需要根据色谱柱的容量和样品的溶解度来确定,以避免过度上样导致的峰形畸变。
一般来说,上述的几个步骤在复杂方法面前,需要来回折腾。
07.分析方法的初步确认
当方法明确之后,我们便要开始做一些分析方法确认的工作,一般有以下几点考虑:
1)
专属性(Specificity):
确保方法可以区分目标分析物和其他潜在的干扰物质,如杂质、降解产物或辅料。
2)
准确度(Accuracy):
通过回收率实验来评估分析方法的准确性,即分析结果与真实值的接近程度。
3)
检测限和定量限(LOD and LOQ):
检测限是方法能够检测到分析物的最低浓度,而定量限是方法能够准确定量分析物的最低浓度。
4)
溶液稳定性(Solution Stability):
确定在特定条件下样品溶液的稳定性,以及样品在储存和处理过程中的稳定性。
5)
操作范围(Operating Range):
确定分析方法在不同实验室或不同操作条件下的适用性。(含色谱柱的耐用性)
6)
历史批次(Historical batches):
对历史批次的样品进行检测,发现其潜在的风险。
08.分析方法的验证
在分析方法确认完成后,便可开展分析方法的相关验证,如果是定量的就按照定量的要求,如果是杂质限度就按照杂质限度的要求等。
在经过上述一套动作之后,恭喜你,开发并完成了一套完整的方法建立。(其中的苦,只有做过的人才知道。)
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