如何优化梯度洗脱程序

在梯度洗脱中，大多数情况下，初始流动相非常弱（比如，含水量高），随时间的推移，有机溶剂的百分比通常是以线性形式增加。梯度洗脱程序一般分为三段，见图1。第一段t1主要是用于上样、极性杂质冲出柱子以及化合物的色谱分离。如分析极性较弱的化合物时，可采用较缓的梯度，降低有机相升高速率，或延长t1段时间，可提高各组分之间的色谱分离度。如分析极性较强的化合物，可在t1段前加一段低比例有机溶剂的洗脱平台，能够增加强极性化合物的保留。但应注意增加保留平台并不能显著改善强极性化合物的保留，应通过更换不同型号的色谱柱来解决该问题。第二段t2主要是用来冲洗色谱柱，将弱极性的杂质及污染物冲洗出色谱柱。t2的时间可通过观察总离子流图基线的走势来决定，如基线持续升高，说明还有未被洗脱出柱的物质，则应延长t2时间；如果基线平稳，说明已完全洗脱，t2时间不必增加。t3段主要是用于色谱柱的平衡，为下一个进样分析做好准备。由于流动相比例的不断变化，色谱柱压力会产生波动，如果不平衡就进行下一针分析，那么色谱柱压力的波动会对后续进样持续造成影响，最终导致保留时间的严重偏离。因此，需要待色谱柱压力平衡至稳定后方可进行下一个样品的分析。t3的时间应根据色谱柱压力平稳需要的时间来决定，应注意不同规格的色谱柱、不同性能的仪器所需的时间是不同的，尤其是在转化液相方法时应具体考虑，不可直接拿来使用。

图1 流动相的基本梯度洗脱程序