蛋白干转仪

8．增加上样量不一定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幂量级的，所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集（可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰）。增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。 仍以6孔板80%以上汇合度为例，细胞裂解液和SDSLB通常都是投入200ul（最少80ul，这样面积的培养板如果裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到一致），而这种浓度条件下制备的样品，电泳时上样量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul时内参基本已经开始粘连成一条线，带型出现波浪纹；当然并非不可以多上样，再多对WB结果影响不大（没有的仍然没有），且条带都很丑。

许多人喝牛奶是为了补钙，不过你如果留心一下国内鲜牛奶包装上的标注，一般没有列出钙的含量，标明的营养成分含量只有两种：脂肪和蛋白质。鲜牛奶有全脂、低脂、脱脂之分，其脂肪含量各不相同，而且在脂肪被视为健康杀手的今天，一般人不会在乎脂肪含量是否达标。蛋白质才是牛奶中的主要营养成分，鲜牛奶包装上都会注着蛋白质含量为100毫升≥2.9克，以表明符合鲜牛奶的国家标准（100毫升≥2.95克）。 生鲜牛奶的蛋白质含量一般在3％以上，所以一般都能达到国家标准，除非往原奶中兑水。要提防有人拿水卖出奶价钱，就有必要在收购生鲜牛奶时检测蛋白质的含量。根据蛋白质的化学性质，有几种检测方法，各有优缺点。食品工业上普遍采用的、被定为国家标准的是凯氏定氮法。这是19世纪后期丹麦人约翰凯达尔发明的方法，原理很简单：蛋白质含有氮元素，用强酸处理样品，让蛋白质中的氮元素释放出来，测定氮的含量，就可以算出蛋白质的含量。牛奶蛋白质的含氮率约16％，根据国家标准，把测出的氮含量乘以6.38，就是蛋白质含量。 所以凯氏定氮法实际上测的不是蛋白质含量，而是通过测氮含量来推算蛋白质含量，显然，如果样品中还有其他化合物含有氮，这个方法就不准确了。在通常情况下，这不是个问题，因为食物中的主要成分只有蛋白质含有氮，其他主要成分（碳水化合物、脂肪）都不含氮，因此凯氏定氮法是一种很准确的测定蛋白质含量的方法。但是如果有人往样品中偷加含氮的其他物质，就可以骗过凯氏定氮法获得虚假的蛋白质高含量，用兑水牛奶冒充原奶。 常用的一种冒充蛋白质的含氮物质是尿素。不过尿素的含氮量不是很高（46.6%），溶解在水中会发出刺鼻的氨味，容易被觉察，而且用一种简单的检测方法（格里斯试剂法）就可以查出牛奶中是否加了尿素。所以后来造假者就改用三聚氰胺了。三聚氰胺含氮量高达66.6%（含氮量越高意味着能冒充越多的蛋白质），白色无味，没有简单的检测方法（要采用“高效液相色谱”这种高科技去检测），是理想的蛋白质冒充物。三聚氰胺是一种重要的化工原料，广泛用于生产合成树脂、塑料、涂料等，目前的价格大约是1吨12000元。在生产三聚氰胺过程中，会出现废渣，废渣中还含有70%的三聚氰胺。造假者用来冒充蛋白质的就是三聚氰胺渣，国内有不少“生物技术公司”在网上推销“蛋白精”，其实就是三聚氰胺渣。在饲料、奶制品中添加“蛋白精”冒充蛋白质，已成了公开的秘密，它的流行让这种本来免费的化工废料的价格攀升到了1吨300～400元。 三聚氰胺是怎么加到牛奶中的呢？有两种可能途径。一种是奶站加到原奶中。这样做有一定的局限，因为三聚氰胺微溶于水，常温下溶解度为3.1克/升。也就是说，100毫升水可以溶解0.31克三聚氰胺，含氮0.2克，相当于1.27克蛋白质，由此可以算出，要达到100毫升≥2.95克蛋白质的要求，100毫升牛奶最多只能兑75毫升水（并加入0.54克三聚氰胺）。另一种途径是在奶粉制造过程中加入三聚氰胺，这就不受溶解度限制了，想加多少都可以。 三聚氰胺在国内之所以被当成了“蛋白精”来用，可能是因为觉得它毒性很低，吃不死人。大鼠口服三聚氰胺，半致死量（毒理学常用指标，指能导致一半的实验对象死亡）大约为每千克体重3克，和食盐相当。大剂量喂食大鼠、兔、狗也未观察到明显的中毒现象。三聚氰胺进入体内后似乎不能被代谢，而是从尿液中原样排出，但是，动物实验也表明，长期喂食三聚氰胺能出现以三聚氰胺为主要成分的肾结石、膀胱结石，并诱发膀胱癌。2007年，从中国出口到美国的宠物食品导致许多宠物肾衰竭死亡，调查表明可能是因为宠物食品中混入了三聚氰胺导致的。那么三聚氰胺是否也会对人有同样的毒性？我们无法拿人体做试验，而即使患肾结石的人曾经服用过偷加了三聚氰胺的食物，也很难确定三聚氰胺就是罪魁祸首，除非患者的食物来源很单一，例如只吃配方奶粉的婴儿——没想到还真有人敢拿婴儿来做试验证明了它能吃死人！ 有人认为既然蛋白质检测法的缺陷导致了致命的造假，还不如干脆取消蛋白质检测，默许牛奶兑水得了。其实凯氏定氮法的缺陷并不难弥补，只要多一道步骤即可：先用三氯乙酸处理样品。三氯乙酸能让蛋白质形成沉淀，过滤后，分别测定沉淀和滤液中的氮含量，就可以知道蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的氮含量。这是生物化学的常识，也早成为检测牛奶氮含量的国际标准（ISO 8968）。“蛋白精”骗局在国内出现已有一些年头，“三鹿奶粉”事件不过是把这一“行业秘密”摆在了公众面前。只有改进国家标准，堵住漏洞，才能挽回人们对国产乳业的信心。2008.9.14（《中国青年报》2008.9.17）转自方舟子博客

实验室准备转做蛋白质组学，哪种质谱仪最好？价格大概在100万左右的哪个公司的质谱仪最适合做蛋白质组学？有推荐的请联系我，QQ：332677682，注明质谱仪。