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生命科学研究过程离不开各类科学仪器的帮助，仪器信息网特别策划话题：“生命科学技术平台经验分享” ，邀请高校、科研院所公共技术平台的老师分享技术心得和经验，方便生命科学领域研究人员了解相关技术进展，学习仪器使用方法。本篇为深圳湾实验室生物影像平台助理工程师黄诗娴供稿。本文详述了转盘共聚焦显微镜的技术原理和优势、历史沿革、功能和主要应用。点击图片了解更多技术1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜。随着激光器技术等各类技术的快速发展，共聚焦显微成像技术更加成熟完备，开始广泛应用于生命科学、材料科学等各个方面。传统的激光点扫描共聚焦显微镜使用逐点扫描，虽然隔绝了非焦平面的杂散光信号，提高了成像分辨率及信噪比，但是成像速度较慢。其光电倍增管检测器PMT的光电转换效率也比较低，需要较强的激发光。为了解决快速变化过程的共聚焦检测问题，实现活细胞长时间成像，发展了转盘共聚焦显微镜（Spinning-disk Confocal Microscopy，SDCM），解决了传统激光点扫描共聚焦显微镜成像速度相对较慢以及光毒性较高的问题。转盘共聚焦显微镜历史沿革和技术优势转盘共聚焦显微镜的概念最早是在1968年由Petrán提出的，在20世纪90年代由日本Yokogawa Electric公司发明了其核心技术：双转盘专利技术。双转盘装置包含了两个同轴排列的转盘，上转盘是带有微透镜阵列的转盘，下转盘是放置在物镜像平面上的带有约20000个阿基米德螺旋状针孔的Nipkow转盘，针孔及微透镜的位置是一一对应的，两个转盘的间距为微透镜的焦距。显微镜工作时，入射光经过微透镜阵列聚焦到Nipkow转盘针孔上，经针孔隔除杂散光后照射在样本上，无需移动载物台或使用扫描振镜，双转盘可进行多点同步扫描，旋转双转盘即可实现对样本的完整扫描，大大提高了采集速度。使用微透镜阵列聚焦激发光，照明光的透射率从使用单Nipkow转盘的4%-6%增加到40%-60%，进一步降低激发光的强度，即使是荧光蛋白表达量非常低的活细胞也可以轻松成像。Yokogawa Electric公司设计了转盘式显微镜目前最先进的共聚焦扫描单元（Confocal Scanner Unit ，CSU）（图1），其CSU-X1转盘最高旋转速度为每分钟10000转，理论上最大帧率高达每秒2000帧。较慢的CSU-W1转盘转速也有4000转，成像速度最大可达200帧/秒，非常适用于快速变化过程检测。图1：Yokogawa转盘共聚焦扫描单元结构示意图（图片来源：Carl Zeiss Microscopy Online Campus）转盘共聚焦显微镜的主要优势之一是使用面阵相机进行成像。激光点扫描共聚焦系统的PMT检测器的量子效率较低，通常为30%-40%，而SDCM使用EMCCD或背照式sCMOS等相机作为探测器，可以具有更高的量子效率，从而降低激发光功率，大大降低了对样品的光漂白和光损伤。为了让相机尽可能多地收集光子，获取高质量图像，应选择高灵敏度的相机。EMCCD相机低噪声、高灵敏，曾经是转盘共聚焦显微系统的第一选择。而如今背照式sCMOS的量子效率可高达95%，且具有与EMCCD相当的灵敏度，其被使用率开始逐渐高于EMCCD相机。此外，背照式sCMOS具有低噪声、高帧率、高动态范围、高分辨率、大靶面的特点，而且功耗更低、集成度更高，成本更低。因此，在未来的发展中，背照式sCMOS有望成为更加主流的图像传感器，应用于各类显微成像技术中。总而言之，转盘共聚焦显微镜因为双转盘技术和高量子效率相机的组合，可以高速运行并且具有非常高的信噪比。转盘共聚焦显微镜主要功能及应用转盘共聚焦显微镜因其成像速度快，层切能力好等特点，常用于多通道荧光成像、拼图及三维成像，如多荧光通道全脑片成像，斑马鱼、透明化小鼠等大组织厚样本三维拼图成像等。转盘共聚焦显微镜可以配置单相机或多相机，配置多个激光器及对应的滤光片组，快速成像多个荧光标记的样本。通过移动电动载物台实现多视野拼图成像，为避免出现拼痕，需做好仪器放大倍数校正、阴影校正及光照均匀度校正等，同时配置合适的拼图软件模块，得到所需大图。通过上下移动物镜或者压电陶瓷载物台实现Z stack三维扫描，结合三维重构软件模块，得到所需三维图像或最大投影图等。因转盘共聚焦显微镜成像采集速度快及光毒性低等优点，非常适合于活细胞成像及活细胞长时程成像，检测信号快速变化过程及信号长时间变化过程，满足细胞动力学、发育生物学等多方面的研究需求。活细胞成像需在显微镜上配置细胞培养装置，提供适宜的培养环境。配置使激光器照明和相机成像达成微秒级别同步的实时控制器，以降低光漂白和光毒性，使细胞在复杂的试验中保持健康的状态。仪器在进行XYT、XYZT成像，甚至是结合多视野、拼图、超分辨的时间序列成像时，需要配置超稳定的锁焦系统使样本始终处于聚焦状态，如Olympus的Z轴漂移补偿系统IX3-ZDC2，Nikon的完美聚焦系统PFS等。进行多视野的时间序列成像时，需要配置高精度的电动载物台，或确保载物台位移精度在可接受范围内。当载物台位移精度较低时，移动到每个成像视野会有较明显的位置偏差，导致成像结果视频中观察的样本出现肉眼可见的抖动现象，高倍镜成像时会更加明显，影响数据查看及成像分析。同时结合相应的分析软件，获得所需活细胞及时间序列的成像分析结果。高内涵细胞成像与分析系统大多使用转盘共聚焦显微成像技术。高内涵细胞成像与分析系统需同时具备自动化高速显微成像功能及自动化图像定量分析功能，可对多个样品快速成像，并从图片中提取大量的数据信息。转盘共聚焦显微成像技术既可以快速地获取多孔板大量的图像数据，并且相较于宽场荧光显微镜而言具有更高的图像分辨率及信噪比，可以提供全自动、高速和高分辨率成像筛选的多种解决方案，能满足药物发现和高通量生物学中多种需求。此外，使用转盘共聚焦显微成像技术还能进行z轴扫描获取三维图像，例如对类器官、组织或3D肿瘤球等三维样本成像，从而进一步分析更多的生理学相关问题。转盘共聚焦显微镜上可以添加各类功能扩展模块，例如超分辨成像模块和光刺激模块等。可以在转盘共聚焦显微镜上添加超分辨成像模块，如Olympus的超分辨技术OSR，是对共聚焦荧光显微镜截止频率附近逐渐减弱的高频信号，进行空间放大的空间频率滤波器，称为OSR滤波器。SpinSR10的SoRa转盘中，在50um针孔盘下添加了微透镜阵列，进一步缩小光斑，提升3~6倍的照明亮度。其可对细胞内深达100微米的区域进行成像，使用常规荧光染料即可在120 nm的分辨率下，采集到各种活细胞样品亚细胞结构的超分辨率图像。还可以在转盘共聚焦显微镜上添加光刺激或光操作实验模块，可进行荧光漂白后恢复FRAP、荧光漂白后缺失FLIP、荧光漂白后定位FLAP、光活化与光转换PA&PC等实验。下一篇作者将根据深圳湾实验室生物影像平台管理经验介绍生物影像平台设备管理心得及未来可提升空间，敬请期待！作者简介黄诗娴，深圳湾实验室生物影像平台助理工程师，南方医科大学生物医学工程硕士，主要负责管理激光共聚焦显微镜、活细胞成像系统、玻片扫描系统等显微成像设备，负责相关设备的管理维护、培训考核、开放共享、成像技术开发等工作。会议预告：12月20-22日生物显微技术大会火热报名中点击图片报名报名链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/swxw2023/

中国电子显微镜学会、仪器信息网联合报道 2023年10月26日-30日，2023年全国电子显微学学术年会在东莞市会展国际大酒店龙泉厅盛大召开。大会由电镜学会电子显微学报编辑部主办，南方科技大学、松山湖材料实验室、大湾区显微科学与技术研究中心共同承办，仪器信息网作为独家合作媒体参会报道。大会共设置13个分会场：显微学理论、技术与仪器发展；原位电子显微学表征；功能材料的微结构表征；结构材料及缺陷、界面、表面、相变与扩散；先进显微分析技术在工业材料中的应用；扫描探针显微学(STM/AFM等)；扫描电子显微学表征(含EBSD)；聚焦离子束(FIB)在材料科学中的应用；低温电子显微学表征；生物显微学研究；生物医学和生物电镜技术；全国电子显微镜运行管理开放共享实验平台经验交流；先进材料。27日和28日下午、29日全天，第九分会场（低温电子显微学表征)、第十分会场(生物显微学研究）、第十一分会场（生物医学和生物电镜技术）和第十二分会场（全国电子显微镜运行管理开放共享实验平台经验交流）分别围绕电镜在生命科学、生物学和医学等领域的应用，以及仪器平台管理和人才培养等热点议题邀请领域内知名专家分享经验。以下是各分会场部分专家的精彩报告内容报告人：南开大学 教授 潘雷霆报告题目：单分子定位超分辨成像及其在免疫检查点上应用潘雷霆教授在报告中提到自主搭建的单分子定位超分辨成像系统（SMLM），揭示了人红细胞CD47以单体形式随机分布于质膜。并提出了二抗交联+SMLM的方法，在近无损条件下定量证明红细胞CD47存在约14%的骨架结合率，且骨架CD47附着于Ankyrin复合物。发现红细胞衰老过程中的CD47密度和聚集能力降低的现象。这为膜蛋白组织分布及与骨架关系研究提供了新方法新策略，提出CD47密度降低和成簇能力变弱共同导致衰老红细胞被吞噬的新观点。报告人：福建医科大学 教授 付志飞报告题目：超分辨电关联成像技术的开发和应用超分辨光学显微成像技术可以提供研究目标精细的结构信息，但是无法获取研究目标所处的超微细胞环境信息。电子显微成像技术具有亚纳米的成像分辨率，但是无法提供研究目标的精确定位。超分辨光电关联成像技术结合了超分辨光学显微成像技术所提供研究目标的精确定位信息与电子显微成像技术所提供研究目标的超微结构信息，是比较前沿的生物成像技术。报告人：国家网络管理平台/北京航天航空大学 总师/教授 刘瑞报告题目：新形势下落实国务院70号文，推动仪器开放共享近年来，科研设施与仪器规模持续增长，综合效益日益显现，但利用率和共享水平低等问题较为突出。因此习近平总书记指出，要把公共财政投资形成的国家重大科研基础设施和大型科研仪器向社会开放，让它们更好为科技创新服务、为社会服务。基于此国家相关部门采取了许多举措，包括建设重大设施和大型仪器国家平台、开展评价考核、开展查重评议及大力宣传和推广国产仪器等，都取得了良好的工作进展，结果令人颇为满意。下一步科技部要发挥牵头作用、加强统筹推动，进一步加大开放共享力度，充分发挥网络管理平台作用。报告人：松山湖材料实验室大湾区显微科学与技术研究中心 正研级高工 吴波报告题目：共享优势资源，助力科技创新：大湾区电镜中心简介及技术交流大湾区显微科学与技术研究中心（简称：大湾区电镜中心）是松山湖材料实验室重大科学装置平台之一，该中心紧密结合松山湖材料实验室总体布局以及粤港澳大湾区未来物质结构研究发展规划。利用超高空间分辨和超高能量分辨像差校正电子显微镜为主的显微分析设备、离子束微纳加工设备以及原子级晶体生长设备，开展基础性、前瞻性研究。以期逐步成为能够代表国家水平的物质微结构研究基地和显微技术人才培养及教育基地，成为具有重要国际影响力的物质结构研究南方基地，未来国家物质结构研究的重要组成部分、粤港澳交叉开放的新窗口。报告人：云南省农业科学院 研究员 张仲凯报告题目：植物布尼亚病毒—Orthotospoviruses在寄主细胞中的分布特征布亚尼病毒（Orthotospoviruses）是一种属于负向单链RNA病毒，人和动物、植物的重要病毒，人和动物感染后会出现肾综合出血热等症状，具有高致死率。种子和果实传播是新发或早生区Orthotospoviruses的主要来源，为源头与绿色防控提供依据。Orthotospoviruses在寄主细胞中的分布特征因病毒种类不同具有明显的差异，可能与N或NSm与寄主蛋白互作的差异相关。Orthotospoviruses以RNPs在细胞间形成系统侵染，同时可能存在溶解细胞壁的发生到达相邻细胞。报告人：西湖大学 研究员 孙异临报告题目：如何做一名超微病理医生孙异临研究员结合自身丰富的临床经验详细解答了如何做好一名超微病理医生。首先要具有扎实的医学基础和丰富的临床经验，要有整体观念，对准备诊断的病理标本的组织学、解剖学等超微结构特点要了如指掌，要了解该病例患者的临床资料，要有全方位综合考虑，才能做出正确的电镜诊断结论。其次要熟悉生物电镜标本制备技术，严谨、细致的把好每一关，苛求把每例标本都做成精品。最后要熟练操作和使用电镜仪器设备，当出现图像畸变、像散等现象时要知道其产生的原因及处理方法。只有精益求精，将每一个步骤都尽可能做到极致，才能成为一名合格的电镜病理诊断医生。报告人：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 处长 张文娟报告题目：从平台支撑迈向能力提升张文娟处长分享了生化与细胞所在平台建设方面的心得与体会，详细介绍了平台从搭建到能力提升过程中的做法。以建设高水平的公共技术支撑平台为总体目标，以技术创新和高效、高质服务为工作重点，整合、优化现有仪器、技术资源，创新管理运行机制，建立了一支高水平、高素质的技术支撑人才队伍。在建设过程中采用规范、细致的日常管理，精心维护、确保仪器正常运行，并且十分注重技术人才队伍的培养，提供全方位的培训服务。未来将不断优化平台质量管理水平，创新管理运行机制，促进开放共享和协作研究。报告人：陕西修业建设工程有限公司 总经理 雷运涛报告题目：改良实验室环境，提高电镜效能报告中谈到之所以要改造电镜实验室是因为实验室周边磁场、地面震动、空气中的噪声都会诱使电子束偏离理想的路径，使成像质量变差。陕西修业就是一家高端实验室规划咨询、工程设计与技术服务的实验室系统解决方案服务商，致力于为用户提供实验室整体设计、施工及智能化的一体化解决方案。可以通过现场评估为实验室改造提供有价值的方案，如重庆大学虎溪校区电子显微镜中心，就是用1200 m2的图书馆改造而成，并将透射电镜、扫描电镜、制样间、培训室等按功能区分为3个区域。

仪器信息网讯 2014年9月25日，Milestone与其在中国的合作伙伴莱伯泰科在第七届慕尼黑上海分析生化展(Analytica China 2014)上举行新品发布会，全球首发新一代微波化学平台ETHOS UP。发布会邀请到有&ldquo 微波化学之父&rdquo 之称的美国杜肯大学H.M.Kingston教授出席并作主题报告，Milestone执行总裁、总经理Diego Cortesi先生及莱伯泰科董事长胡克博士等公司高层出席发布会。发布会由莱伯泰科副总经理邓宛梅女士主持。 发布会现场 国杜肯大学H.M.Kingston教授致辞 　　据H.M.Kingston教授介绍，从上世纪80年代开始，微波开始应用于样品的消解和萃取 到了上世纪90年代，微波开始应用于合成，本世纪初，微波可以应用到肽合成及同位素平衡研究。近两年，随着技术的发展，微波固相萃取及微波自动化萃取等开始出现。 Milestone执行总裁、总经理Diego Cortesi先生致辞 　　作为专注于微波化学产品的供应商，Milestone涉足此领域已有26年历史，并且一直在持续创新，它开创了高压微波化学时代，把多项新技术引进微波化学领域。此次推出的ETHOS UP在仪器硬件、操作界面、监控手段等方面都进行了极大改进，可以应用于微波萃取、微波合成、蛋白质水解、浓缩干燥等多种应用领域。 Milestone执行总裁、总经理Diego Cortesi先生与莱伯泰科董事长胡克博士揭幕新品 新一代微波化学平台ETHOS UP 　　具体而言，(1)ETHOS UP在仪器整体体积基本不变的情况下拥有大的反应腔体，腔体达70L，可以同时进行44个大容积样品罐的消解 (2)ETHOS UP具有最大的微波发射功率，微波输出功率可达1900W，同时采用Power enable特殊能量优化设计，使能量利用最大化 (3)ETHOS UP具有视频监控系统和直接防爆监控双重保护，全自动自吸门与智能门锁都更好地保护操作人员安全 (4)ETHOS UP智能控制单元内置了上千种国际国内标准英语方法，用户只需点击形象化图标，就可显示方法，一键操作，智能消解 (5)ETHOS UP采用直接温度控制及红外传感器温度控制两种模式，保证了控温的精确 (6)全新设计的消解转子，超高压转子可同时消解15个样品 (7)ETHOS UP采用创新不锈钢涡流冷却系统，城北提高消解罐原位风冷速度，从200摄氏度降到40摄氏度只需10分钟 (8)无线网络控制，可以任意时刻、地点监控仪器运行情况和过程。 　　在新品发布后的讲座中，H.M.Kingston教授还特别分享了其利用微波消解平台与其他分析技术联用研究自闭症的形成原因。H.M.Kingston教授利用微波消解平台与ID-ICP-MS(同位素稀释电感耦合等离子体质谱)、GC-MS等技术联用测定了自闭症患者的血液等样本。最终发现自闭症并不是遗传造成的，而是由于环境中50多种化合物对女性的影响，从而导致孩子患自闭症。此外，H.M.Kingston教授还介绍了涉及微波消解技术标准的变化情况。