溶瘤病毒

p style=" text-align: justify " 　　溶瘤病毒疗法是一种通过病毒选择性感染肿瘤细胞来杀伤肿瘤的新型肿瘤治疗方法。溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，能选择性感染肿瘤细胞并在肿瘤细胞中复制继而杀伤肿瘤细胞，并刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫反应。主要分为两大类，一类是天然对于肿瘤细胞具有特异性感染或杀伤能力的病毒，比如呼肠孤病毒、新城疫病毒等 另一类是经过人为改造过，对于肿瘤细胞具有特异杀伤能力的病毒，比如腺病毒、单纯疱疹病毒等。自然界中只有少数病毒可以自然地发生溶瘤，大多数需要进行基因改造后才能实现对肿瘤细胞的靶向感染和治疗的作用。 br/ /p p style=" text-align: justify " 　　溶瘤病毒主要分为两类： strong 天然病毒株与基因改造病毒株 /strong 。(1)天然病毒株指自然状态下未经修饰或连续传代后毒力衰减的病毒株，包括野生型及自然变异的弱病毒株。如呼肠弧病毒、新城疫病毒、流行性腮腺炎病毒、西尼罗河病毒、腺病毒、牛痘病毒。(2)基因改造病毒株：删除病毒某些关键基因、加载外源治疗基因、病毒必须基因前插入组织或肿瘤特异性启动子来控制溶瘤病毒在肿瘤细胞内复制。如：加载粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的JX-594、T-vec、DNX-2401。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/5646ff9d-fce2-4751-b0a5-68372d40059f.jpg" title=" 11.jpg" alt=" 11.jpg" / /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/9f7d04c7-48e8-47b6-b0f0-a6d64e504232.jpg" title=" 11.jpg" alt=" 11.jpg" / /p p style=" text-align: justify " 　　溶瘤病毒主要通过以下三种机制发挥抗肿瘤作用[1]。 /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 1)肿瘤选择特异性机制： /strong 通过对病毒感染宿主所需的关键蛋白进行修饰，降低病毒对正常组织的感染，从而实现病毒对肿瘤细胞的特异性感染，同时病毒只在肿瘤细胞中复制，在正常细胞中不复制，继而实现对肿瘤的靶向击杀 /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 2)病毒介导的肿瘤杀伤机制： /strong 溶瘤病毒成功靶向并感染肿瘤细胞后，病毒以细胞作为加工厂进行大量复制，最终达到裂解肿瘤细胞的目的，肿瘤细胞裂解后释放的子代病毒又继续感染邻近的肿瘤细胞 /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 3)抗肿瘤免疫反应机制： /strong 病毒进入机体后会引发免疫系统的清除，诱导淋巴细胞和抗原递呈细胞(APCs)浸润肿瘤感染位点，同时病毒裂解肿瘤细胞后释放的肿瘤抗原可增强 APCs 的抗原递呈能力，从而产生针对肿瘤抗原的特异性免疫反应，最终形成长效的抗肿瘤免疫应答，可有效防止肿瘤的复发和转移。 /p p style=" text-align: justify " 　　溶瘤病毒相比其他肿瘤免疫疗法具有明显优势，潜力巨大，具有安全性可靠、疗效好等优势，如下图： /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/4bee2d85-5111-49e1-97fe-a92f6f8da472.jpg" title=" 22.jpg" alt=" 22.jpg" / /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 目前全球有三款药物成功获批上市 /strong ，溶瘤病毒技术基本成熟。全球范围内首个被认可的是 2015年FDA批准的T-vec，被批准用于首次手术后复发的不可切除的侵犯皮肤、皮下和淋巴结的黑色素瘤患者的局部治疗。除此之外， 2004 年 Rigvir在拉脱维亚获批治疗多种癌症，主要是黑色素瘤，根据资料显示，75%的拉脱维亚黑色素瘤患者已经接受了Rigvir疗法 2005 年安柯瑞在我国获批用于治疗原发灶、临床晚期、复发的头颈部肿瘤。 /p p style=" text-align: justify " 　　CFDA获批方面， strong 我国第一个批准的溶瘤病毒是上海三维(Sunway)生物技术公司研发的H101基因修饰溶瘤腺病毒 /strong ，其在2005年获得CFDA批准上市，用于治疗头颈部肿瘤。Oncolytics生物技术公司的Reolysin正处于治疗头颈癌的III期临床试验。临床资料显示，这个III期临床试验显示获得了统计学意义的肿瘤缩小 此外，结肠、直肠癌的早期结果总共有31项临床研究已经完成或正在进行中，其中包括许多Reolysin试验以及各种实体肿瘤的标准化疗方案等。 /p p style=" text-align: justify " strong 　　目前处于临床II期的产品包括： /strong /p p style=" text-align: justify " 　　1) Jennerex公司的JX-594目前正处于肝细胞癌的II期临床试验阶段，JX-594是胸苷激酶缺失的痘苗病毒并融合了GM-CSF。 /p p style=" text-align: justify " 　　2)Seneca Valley病毒(NTX-010)和(SVV-001)是溶瘤型小核糖核酸病毒，用于治疗小细胞肺癌和神经母细胞瘤。 /p p style=" text-align: justify " 　　3)ColoAd1由Psioxus Therapeutics公司使用定向进化的方法开发的溶瘤病毒，已成功完成了临床I期试验。这些患者使用的病毒样品经过静脉内递送后显示在肿瘤部位内病毒大量复制而正常组织影响甚小。 /p p 　　4)Cavatak 是一种柯萨奇病毒，正处于恶性黑色素瘤治疗的II期临床试验中。 /p p style=" text-align: justify " 　　5)ONCOS-102是编码人GM-CSF的人血清型5/3腺病毒，其经过优化以诱导癌症患者的全身性抗肿瘤T细胞应答。对恶性胸膜间皮瘤的治疗已经进入II期临床试验。 /p p 　 strong 　处于临床I期的产品包括： /strong /p p style=" text-align: justify " 　　1)Virttu Biologics的SEPREHVIR(HSV-1716)完成胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌和黑素瘤的I期临床实验。 /p p style=" text-align: justify " 　　2)Oncos Therapeutics公司的CGTG-102(Ad5/3-D24-GMCSF)已经在公司Advanced Therapy Access Program中用于治疗200名晚期癌症患者。 /p p style=" text-align: justify " 　　3)由Genelux开发的GL-ONC1处于静脉给药用于实体瘤的临床实验Ib阶段。正在进行其他试验，包括恶性胸腔积液患者的胸腔内给药，晚期腹膜癌病人腹腔注射，腹腔内注射复发卵巢癌在头颈部癌症。 /p p style=" text-align: justify " 　　截至2018年9月，有多项关于溶瘤病毒的交易与合作项目在中国药企中展开。包括法国生物技术公司Transgen与天士力的合作、Jennerex Biotherapeutics的JX-594、Tocagen的Toca-511以及Oncolytics Biotech的Reolysin。 /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 溶瘤病毒联合免疫疗法潜力巨大 /strong /p p 　　溶瘤病毒联合免疫检查点抑制剂可以增强原有疗效 /p p style=" text-align: justify " 　　1、两项重磅研究展示了溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂联合疗法的强大疗效。 /p p style=" text-align: justify " 　　2017 年 9 月，国际著名期刊《Cell》发表了 PD-1 抗体 Keytruda 与溶瘤病毒疗法 Lmlygic(T-vec)联合治疗黑色素瘤患者的一项重磅临床数据。结果表明，联合治疗可以使患者的应答率提升至62%，远远高于单独使用Keytruda或T-vec治疗的预期缓解率(通常约为 35%-40%)。同年10月全球生物制药巨头Amgen(安进)也公布了一项溶瘤病毒Lmlygic(T-vec)联合检查点抑制剂CTLA-4抗体治疗黑色素瘤的最新临床数据。结果表明，联合疗法使患者的总体反应率比CTLA-4抗体 Yervoy(Lpilimumab)单药治疗翻了一番。 /p p style=" text-align: justify " 　　2、溶瘤病毒联合免疫检查点抑制剂可以治疗对免疫检查点抑制剂疗效甚微的“冷肿瘤”。 /p p style=" text-align: justify " 　　临床试验结果显示，免疫检查点抑制剂对于三阴性乳腺癌和脑肿瘤患者疗效甚微，但是 2018 年1月发表在《Science Translational Medicine》的两篇论文发现，免疫疗法联合溶瘤病毒可以治疗侵袭性乳腺癌和致命脑瘤。研究发现，早期给予的溶瘤病毒治疗(在手术切除之前)改变了抗肿瘤免疫应答，并且增强了随后接受免疫检查点抑制剂治疗的效果。 /p p style=" text-align: justify " 　　3、与 CTLA-4 和 IDO 抑制剂组合相比，溶瘤病毒联合免疫检查点抑制剂组合效果更优。 /p p style=" text-align: justify " 　　临床试验结果显示，溶瘤病毒T-vec与PD-1抑制剂Keytruda的联用不仅有效率更高，而且3-4级副作用的发生率也显著低于CTLA-4和IDO抑制剂组合，由此可见，溶瘤病毒联合免疫检查点抑制剂组合未来潜力巨大，有望超越原有联合免疫疗法。 /p

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是一组具有髓系特征的多发性异质性恶性肿瘤。通过化疗、放疗、造血干细胞移植、支持性治疗和靶向治疗等方式，可以提高患者五年总存活率；但是，与其他血液肿瘤相比，AML的治疗效果较差，最常见的表现是缓解后复发。因此，对于复发和化疗耐药的患者来说，迫切需要寻找新的具有有效和可控副作用的治疗药物和技术。溶瘤病毒（Oncolytic Virus, OVS）是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，通过直接溶解感染的肿瘤细胞和间接增强宿主的抗肿瘤免疫力来介导肿瘤细胞的破坏。其种类有：新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、单纯疱疹病毒-1（Herpes simplex virus-1, HSV-1）、呼肠孤病毒（Reovirus）和溶瘤腺病毒（Oncolytic adenovirus）等。由于OVS优先破坏肿瘤细胞，而对正常细胞无害，同时越来越多的研究证据表明，AML细胞感染溶瘤病毒会显著增加肿瘤细胞的死亡率，这为AML的治疗提供了新的方法和思路，已经在多个临床试验中进行了安全性和可行性的探索。然而，B淋巴细胞会对血液循环中的OVS产生中和抗体(Neutralizing Bntibodies、NAbs)，从而阻止病毒的传播，最终会降低病毒的治疗效果。▲ OVS的双重作用模式，优先靶向并杀死癌细胞，而对正常细胞几乎没有有害的影响间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)，具有多向分化潜力的多能干细胞。在过去的十年中，MSCs被认为是OVS的理想载体，其原因有：(1)、MSCs为病毒提供了一个复制场所；(2)、MSCs能避免被免疫系统清除；(3)、MSCs确保病毒能到达肿瘤部位；(4)、MSCs会分泌细胞因子，增强抗肿瘤免疫反应。然而，携带溶瘤病毒的人脐带来源的间充质干细胞(Human umbilical cord-derived MSCs, Huc-MSCs)的抗肿瘤效果及其分子机制尚不清楚。▲ 间充质干细胞的分化潜力近日，贵州医科大学成体干细胞转化研究重点实验室赵星和何志旭教授课题组首次报道Huc-MSCs作为呼肠孤病毒的细胞载体，并使用博鹭腾AniView100多模式动物活体成像系统检测携带呼肠孤病毒的Huc-MSCs和MSCs在活体内对AML的治疗效果和抗肿瘤效果。该工作有助于提升研究人员对MSCs携带OVS的抗肿瘤机制的理解，并可能为临床治疗AML提供新的策略。相关成果已在国际著名期刊《International Immunopharmacology》发表。评价携带呼肠孤病毒的Huc-MSCs在体内的治疗效果。根据荧光素酶报告基因可用于体内移植的Huc-MSCs的定量，将呼肠孤病毒(Luc-MSCs-Reo)负载于Huc-MSCs，并静脉注射注射到AML小鼠模型内。通过博鹭腾AniView100多模式动物活体成像系统进行成像，结果显示Huc-MSCs位置同肿瘤THP-1细胞定位相同。小鼠的Kaplan-Meier生存曲线结果表明，接受呼肠孤病毒感染的Huc-MSCs的小鼠的中位存活时间比接受裸鼠呼肠孤病毒的小鼠显著增加。这些数据证实了Huc-MSCs作为呼肠孤病毒载体具有良好的治疗效果。▲ 携带呼肠孤病毒的Huc-MSCs对AML小鼠模型的治疗作用评价携带呼肠孤病毒的MSCs的体内抗肿瘤效果。建立具有免疫活性的小鼠AML模型，通过博鹭腾AniView100多模式动物活体成像系统进行成像，结果显示标记DIR的MSCs和呼肠孤病毒感染的MSCs对C1498肿瘤具有肿瘤归巢能力，提示携带呼肠孤病毒的MSCs维持其固有的向肿瘤细胞迁移的能力。根据各组的肿瘤体积和重量、肿瘤中的病毒RNA定量显示、治疗后小鼠血清干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α水平及免疫组织化学法观察到肿瘤中CD8的表达结果，可得MSCs有效地将呼肠孤病毒运送到肿瘤部位，并触发小鼠的免疫反应，对肿瘤生长有明显的抑制作用。这些结果证实了MSCs载体能够增强呼肠孤病毒的抗肿瘤效果。▲ 携带呼肠孤病毒的MSCs对C57BL/6小鼠C1498肿瘤的治疗作用

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 消化道相关病毒对人体健康产生重大威胁，尤其是乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒，在中国有数量庞大的患者。乙型肝炎病毒感染者无论在潜伏期、急性期或慢性期，其血液都具有传染性。临床上主要通过注射乙肝疫苗来达到预防的目的。一旦感染乙肝，目前治疗方案主要有NUC治疗，而NUC治疗只能干扰DNA合成，并不能将乙肝病毒从患者体内清除，因此具有很高的反复性。丙型肝炎病毒（慢性感染）为一类致癌物。临床丙型肝炎病人50%可发展为慢性肝炎，甚至部分病人会导致肝硬及肝细胞癌。非常遗憾的是医学界尚未研制出有效预防丙肝的疫苗。因为丙肝病毒是RNA病毒，极易变异，研制疫苗的难度很大。质谱流式在这两种病毒方向的应用主要涉及到临床治疗方案的改善，疫苗的效价评估及潜在治疗靶点的探索。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 消化道相关病毒 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 目前质谱流式在消化道相关病毒的研究主要集中在轮状病毒，乙型肝炎病毒HBV和丙型肝炎病毒HCV三种病毒领域。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 轮状病毒（ rotavirus）肠炎是由轮状病毒所致的急性消化道传染病。病原体主要通过消化道传播，主要发生在婴幼儿，常由A组轮状病毒引起，发病高峰在秋季，故名婴儿秋季腹泻。B组轮状病毒可引起成人腹泻。轮状病毒领域目前已发表文献涉及到T细胞结合表位筛选和寻找轮状病毒特异性B细胞亚群。T细胞结合表位筛选利用新发现的质谱流式和MHC四聚体技术相结合，创建了一种高通量筛选的技术。该技术用金属标签替代四聚体上的荧光基团，进而可以用质谱流式进行检测，从根本上解决荧光串色问题，提升单次检测通道。加之他们用三金属组合的方式标记四聚体来取代传统单金属标记的方法，进一步增加筛选的通量，用10种金属就可以实现120种抗原肽的筛选。利用该方法，Newell等人对人体内轮状病毒的109个MHC四聚体上77个T细胞潜在结合位点进行筛选，在健康个体的血液中鉴定出6个限制于人白细胞抗原（HLA）-A *0201的T细胞表位。值得一提的是，研究还发现特异性结合轮状病毒VP3蛋白的T细胞具有独特的表型，并在肠道上皮中大量存在。轮状病毒相关B细胞研究中，Nair, N.等人在轮状病毒上标记金属离子，进而研究在肠道中特异性结合在轮状病毒VP6结构性蛋白的B细胞亚群特征，揭示肠道B细胞组成异质性及其与肠道分泌细胞之间的关系。这些研究揭示出轮状病毒感染后抗原呈递及免疫反应特征，对于今后轮状病毒治疗及疫苗研发提供重要的理论基础。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " HBV相关研究涉及到感染进程及临床治疗两个方向。利用上述质谱流式和多肽-MHC四聚体技术的结合，Cheng, Y.等人对不同阶段HBV患者体内T细胞进行HBV基因组中HLA-A*1101限制性484种T细胞潜在结合位点进行了筛选，最终发现特异性结合HBV(pol387)和HBV(core169)表位的T细胞随着疾病发展呈现出明显分化和异质性。根据这些T细胞表型变化，作者绘制出HBV疾病进展图谱。如此深入的研究对于今后HBV感染阶段分型及治疗策略有很好的指导意义。临床治疗方面，Rivino, L.等人利用质谱流式探索HBV感染后NUC治疗停止治疗判定标准。发现患者体内是否存在功能性HBV-特异性T细胞亚群可作为慢性HBV患者停药的潜在生物标志物。慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的慢性炎症增加了肝细胞癌（HCC）的风险。但是，关于HBV相关HCC的免疫状况及其对有效癌症免疫疗法设计的影响知之甚少。Lim, C. J.等人利用免疫组化和质谱流式技术，对HBV相关的HCC和非病毒相关的HCC的免疫微环境进行了细致研究，找到HBV相关HCC的独特免疫亚群，结合患者预后信息，作者发现Treg与HCC的预后不良相关，而Trm与HCC的预后良好相关。这种深入的研究对今后HCC的治疗和免疫疗法的适当应用具有重要意义。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " HCV感染全球数以百万计的人，是肝硬化和肝细胞癌的主要原因。而针对丙型肝炎病毒（HCV）的保护性疫苗仍未满足临床需求。已有成果利用质谱流式对新研发HCV疫苗疗效进行评价，单次实验可分析更多的免疫亚群反应。Doyle, E. H.等人用质谱流式对HCV感染后肝脏中的pDC功能进行分析，发现pDC是肝脏中唯一的单个核细胞，依旧具备多功能性，可大量分泌IFNα等多种细胞因子。可在今后治疗方案改善中作为潜在靶标。这些研究对于临床均具有重要的应用和指导意义。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 人乳头瘤病毒（HPV） /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " HPV感染会引发的宫颈癌和口咽鳞状细胞癌。质谱流式对两种肿瘤免疫微环境的研究发现。虽然是同一种病毒感染，但是由于组织类型的不同，其免疫微环境呈现出很大的差异性。这说明组织类型会显著影响肿瘤中的免疫渗透概况。这对治疗方案的调整有很大的指导意义。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 口咽鳞状细胞癌的可分为HPV阴性和HPV阳性。质谱流式对这两种类型患者的综合免疫亚群分析结合临床情况，发现患者肿瘤内存在I型HPV16特异性T细胞会提升其整体生存率，缩小肿瘤大小，减少淋巴结转移。并且会改变肿瘤微环境，使其呈现出响应标准治疗的特征。这些发现说明在口咽鳞状细胞癌中引入HPV16特异性T细胞会提升治疗效果。对临床治疗具有很大的启发。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 小结 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 本文对质谱流式在消化道相关病毒和人乳头瘤病毒方向的文献进行汇总，所列文献涉及到的应用方向如下：1、病毒感染T细胞识别表位筛选，2、疫苗评估，3、确定疾病分型标准，发现biomarker的研究。在这些应用方向，质谱流式的单细胞多通道检测有其不可替代的优势。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 2013年开始兴起的技术——质谱流式与多肽-MHC四聚体技术相结合——在近两年呈现出越来越多的高水平成果。得益于质谱流式的单细胞多通道检测，利用该技术在筛选T细胞表位的同时，还可以对抗原特异的T细胞进行多参数的表型和功能分析；一次得到更多更准确的病毒特异性T细胞及抗原呈递信息，这对疫苗的研发有着举足轻重的作用。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 疫苗研发和效价评估方面。疫苗注射后所引起的免疫反应也是全方面的。能够评估的免疫亚群越全面，对于效价的评估越准确。质谱流式在这方面有其得天独厚的优势。从最开始的抗原表位筛查到注射疫苗后免疫反应的评估，质谱流式都可以大大提升覆盖度，使得研究更加快速，结果更加准确。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 综上，质谱流式在：1、病毒感染T细胞识别表位筛选，2、疫苗评估，3、确定疾病分型标准，发现biomarker的研究领域都有着传统流式无法比拟的优势，可助力研究人员在单次实验中拿到更多的信息，对免疫系统进行更加综合全面系统的评估。 /p p br/ /p