迁移试验

细胞迁移的背景与应用及实验方法！ 一、背景 细胞迁移指即细胞划痕法，是测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型。在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其他硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。 当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。 二、实验方法 1、培养板接种细胞之前先用marker笔在12孔板背面画横线标记（方便拍照时定位同一个视野）。 2、细胞消化后接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜（数量少时可培养一段时间至铺满板底）。 3、细胞铺满板底后，用1ml枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。（人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷）。 4、吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。 5、加入无血清培养基，拍照记录。 6、将培养板放入培养箱培养，每隔4-6小时取出拍照。 7、根据收集图片数据分析实验结果。 三、应用 细胞迁移可以用于NFIC1抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭的分子机制的研究： 探究了NFIC1对Luminal A型和三阴型乳腺癌转移的影响和相关机制。本研究将NFIC1的过表达质粒和si RNA分别转染入MCF7和MDA-MB-231细胞中,Wound healing和Transwell实验结果显示,过表达NFIC1能明显抑制MCF7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭 敲低NFIC1能显著促进MCF7和MDA-MB-231细胞的迁移能力和对Matrigel胶的侵袭能力。 为了探究NFIC1抑制迁移和侵袭的分子机制,我们在MCF7和MDA-MB-231细胞中分别瞬时过表达NFIC1后,对NFIC1过表达及其对照细胞进行了RNA测序。对MCF7细胞测序结果的分析发现,对照组与过表达NFIC1组差异基因主要富集在由干扰素介导的Jak-STAT通路上。 随后,我们证实了过表达NFIC1能促进IFNL1、IFNL2/3和IFNB1的表达和分泌,同时也能激活Jak-STAT通路。接下来,我们在过表达NFIC1后使用Jak-STAT通路抑制剂Filgotinib和Ruxolitinib来阻断Jak-STAT通路,发现阻断Jak-STAT通路能逆转NFIC1抑制MCF7细胞迁移和侵袭的效果。 进一步根据测序结果,在过表达NFIC1的细胞中分别敲低Jak-STAT通路的下游靶基因MX1、MX2和RARRES3,发现敲低MX1和MX2能减弱NFIC1过表达对迁移和侵袭的抑制作用。最后,我们在过表达NFIC1同时分别敲低IFNL1、IFNL2/3和IFNB1,此时Jak-STAT通路受到明显抑制、MX1和MX2的表达显著降低、并且NFIC1抑制迁移和侵袭的作用也遭到削弱。 以上结果表明NFIC1在MCF7细胞中通过促进IFNL1、IFNL2、IFNL3和IFNB1的表达激活了Jak-STAT通路,活化的Jak-STAT通路通过上调MX1和MX2的表达来抑制MCF7细胞的迁移和侵袭。通过对MDA-MB-231细胞测序结果中差异表达基因的筛选及验证,我们发现NFIC1能直接结合在S100A2启动子区域从而上调S100A2的表达。 敲低S100A2能逆转NFIC1对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的抑制效果。随后我们发现过表达NFIC1后MEK和ERK的磷酸化水平受到明显的抑制,敲低S100A2能逆转NFIC1对MEK/ERK通路的抑制状态。进一步,在MDA-MB-231细胞中过表达NFIC1同时敲低S100A2后,使用U0126抑制MEK/ERK通路能解除敲低S100A2对迁移和侵袭的逆转效果。 同时,过表达NFIC1上调S100A2后能通过抑制MEK/ERK通路来抑制MDA-MB-231细胞的上皮间充质转化。以上结果表明NFIC1在MDA-MB-231细胞中通过上调S100A2的表达来抑制MEK/ERK通路,进而诱导MDA-MB-231细胞由间充质形态转化为上皮形态,最终抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。 北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

1 信息细胞迁移在许多复杂的生理和病理过程中起着重要作用。伤口愈合测定是研究体外细胞迁移的简单方法。该测定基于以下观察：在汇合的单层中人工产生的间隙边缘上的细胞将迁移直至建立新的细胞 - 细胞接触。ibidi Culture-Insert 2 Well为伤口愈合实验提供了完整的解决方案，从样品制备到图像分析只需要几个步骤。本应用简报是使用ibidi Culture-Insert 2 Well 在24孔培养板上分析MCF-7细胞迁移实验的详细方案。并行测试了五种不同浓度的人表皮生长因子（hEGF）对迁移行为的影响并与对照条件进行比较。2 材料 细胞：MCF-7 (ATCC: HTB-22 DSMZ: ACC115) ibidi实验耗材: Culture-Insert 2 Well 24, ibiTreat (ibidi, 80241) 细胞培养表面：ibiTreat 细胞培养基：RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804) 细胞解离溶液：Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C) 生长因子：human epidermal growth factor (hEGF) (Promokine, C-60170) 无菌镊子 倒置显微镜，最好具有自动图像采集系统和用于活细胞成像的顶部培养箱 3 实验工作流程在该实验中测试了hEGF对MCF-7细胞迁移行为的影响。使用五种不同的hEGF浓度，并将迁移行为与未用hEGF处理的对照细胞进行比较。图1实验装置：测试了五种不同的hEGF浓度（绿色）（5,10,20,30,40ng / ml）。未处理的细胞（白色）作为对照。对每种条件进行四次技术重复。 3.1 步骤1：细胞接种正确的接种浓度是一个关键参数，因为24小时后应达到汇合的单层。需要进行预实验以确定所用细胞系的最佳浓度。1. 取下附在μ-Plate底部的保护膜（图2A）。2. 像往常一样准备细胞悬液。建议包括离心步骤以去除死细胞和细胞碎片。将MCF-7细胞悬浮液调节至细胞浓度为5×10 5 细胞/ ml。3. 将70μl细胞悬浮液应用于2孔的培养插件每个孔中（图2B）。避免摇动μ-Plate，因为这会导致细胞分布不均匀。4. 将细胞在37°C和5％CO2 培养至少24小时。图2在开始细胞接种步骤（A）之前取下保护膜。将70μl细胞悬浮液填充到2孔培养插件（B）的每个孔中。3.1 第2步：划痕形成μ-Plate 24 Well的使用并行测试五种不同的hEGF浓度和对照条件。每种实验条件可以进行四次技术重复（图1).1. 在显微镜下观察培养24小时后的细胞密度。如果24小时后未达到融合细胞单层，则将μ-Plate于细胞培养箱中再培养几个小时。定期检查汇合点。2. 将生长因子添加到细胞培养基中以获得以下浓度：0,5,10,20,30和40ng / ml EGF。3. 用无菌镊子轻轻取出2孔培养插件。要移除培养插件，请抓住一个角，如图3所示。4. 用无细胞培养基或PBS洗涤细胞层以除去细胞碎片和未附着的细胞。5. 小心吸出无细胞培养基或PBS。6.用移液管将1ml细胞培养基加到24孔板的每个孔中。图3使用无菌镊子取出2孔培养插件3.1 第3步：获取显微镜图像我们建议录制延时视频，以确定时间依赖性和细胞迁移的特征。1. 将μ-Plate 24孔培养板放在显微镜上并确定所有24个孔的位置。2. 在接下来的几个小时内多次拍摄图像，开始观察过程。在24小时内每30分钟拍摄一次图像。4 结果分析显微图像以获得关于培养细胞迁移特征信息。分析细胞覆盖区域随时间的变化来确定细胞速度。图4 hEGF对MCF-7细胞迁移行为影响的比较。测试了四种不同的EGF浓度，并与对照实验进行了比较。使用Culture-Insert 2 Well 在24孔培养板上进行测试六种不同（或更多）的条件。通过比较细胞速度与对照条件的速度来分析五种不同hEGF浓度（每种重复四次）的影响。实验数据显示，与对照组相比，hEGF增加了MCF-7细胞的细胞速度。如图4所示，hEGF 10ng / ml的浓度显示细胞速度没有进一步增加。

p 　　GB 5009.156-2016《食品接触材料及制品迁移试验预处理方法通则》(以下简称新标准)于2016年10月19日发布，2017年4月19日实施。 /p p 　　该标准替代了GB/T 5009.156-2003《食品用包装材料及其制品的浸泡试验方法通则》(以下简称旧标准)。小编今天就把新标准的修改变化和使用过程的注意事项与大家分享。 /p p 　　新标准与旧标准相比较，主要变化如下： /p p 　　1. 标准名称修改为“食品安全国家标准 食品接触材料及制品迁移试验预处理方法通则” /p p 　　2. 修改了术语和定义 /p p 　　3. 增加了试验总则 /p p 　　4. 增加了试剂和材料 /p p 　　5. 增加了设备与器具 /p p 　　6. 修改了采样与制样方法 /p p 　　7. 修改了试样接触面积 /p p 　　8. 增加了试样接触面积与食物模拟物体积比 /p p 　　9. 修改了试样清洗 /p p 　　10. 修改了试验方法 /p p 　　11. 增加了迁移量的测定要求 /p p 　　12. 修改了结果表述要求 /p p 　　13. 删除了原标准“附录A 食品用包装材料采用方法” /p p 　　14. 删除了原标准“附录B 浸泡试验项目及试验条件” /p p 　　15. 增加了附录A、附录B、附录C、附录D /p p 　　其中新标准增加的设备要求中恒温设备是保证迁移试验的关键因素。新标准对恒温设备的要求如下： /p p 　　恒温设备(恒温箱、培养箱、水浴锅、冰箱等)应保证迁移试验达到规定的温度，并可控制食品模拟物温度，温度的误差应符合附录C中表C.1的规定。 /p p 　　 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/318c4aa4-acbe-4917-a02d-5e032f4f7926.jpg" style=" width: 600px height: 370px " title=" 1.jpg" vspace=" 0" hspace=" 0" height=" 370" border=" 0" width=" 600" / /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/900c65c4-fea7-4b79-ae14-d40b526b8cce.jpg" style=" width: 600px height: 370px " title=" 2.jpg" vspace=" 0" hspace=" 0" height=" 370" border=" 0" width=" 600" / /p p 　　由此可见，对于食品接触材料及制品迁移试验预处理，选择一款恒温范围足够宽广，能长期运行并安全的恒温设备是非常重要的。 /p p 　　某出入境检验检疫局食品接触材料实验室按照旧标准做食品包材材料的浸泡试验时使用的是德国IKA恒温循环器，对其温度范围、升温速率、稳定性及安全性都有非常好的评价。 /p p 　　 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/12d02a4c-aad4-4322-9886-c3306f256eec.jpg" title=" 3.jpg" style=" width: 567px height: 383px " vspace=" 0" hspace=" 0" height=" 383" border=" 0" width=" 567" / /p p style=" text-align: center " strong 某食品接触材料实验室 /strong /p p 　　德国IKA恒温循环器温度范围-25~250℃，控温精度高达± 0.01℃，设备可长期稳定运行，曲线实时现实控温过程，保证长期控温实验温度数据的可靠性。 /p p 　　此外，IKA更关注实验细节及用户的实际使用体验，可提供多种附件。如下图的可调升降台，可以保证各种规格的样品稳定的放置在恒温循环器中，再也无需担心小量样品漂浮的问题了。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/bc88c6e9-1dcd-41cb-b901-e9bf1436d5ce.jpg" title=" 4.jpg" style=" width: 600px height: 390px " vspace=" 0" hspace=" 0" height=" 390" border=" 0" width=" 600" / /p