灭菌技术

消毒及灭菌的定义：1.消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。区分为高程度消毒（High-level Disinfection）、中程度消毒（Intermediate-level Disinfection）、低程度消毒（Low-level Disinfection）三种方式。2.灭菌的定义：以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。灭菌消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。本版关于灭菌的话题已有730贴， 关于灭菌的话题已有320 贴，这些帖子的绝大多数是讨论了一些关于消毒灭菌的具体操作技术。本贴的主旨是从应用微生物技术的角度来谈论这个老话题，希望战友们积极参与。我先开个头，简单介绍一下几种非热灭菌技术。大家还可以进行补充和详细谈论。1.冷冻真空干燥(vacuo-lyophilization)灭菌冷冻：－20℃以下，细胞原生质内水分结冰，破坏其胶体状态并机械挤压，刺伤菌体而死亡。真空：抽去空气呈低氧或绝氧状态，抑制正常呼吸干燥：导致菌体脱水和盐类浓度增高，抑制代谢活动正常进行2.微波(microwave)灭菌微波：是频率范围为300~300000MHz的无线电波，与其他波段的无线电波相比，其具有波长短，振荡周期短，似光波性和频率很高等特点。微波灭菌机理：微波的热效率高；介质分子振荡旋转速度快；菌体脱水，蛋白质凝固；染色体、细胞膜、酶系统发生变性。3.γ射线(γ-ray radiation)灭菌γ射线：是一种波长非常短能量非常大，有强烈穿透力使物质产生电离作用的电磁波。γ射线灭菌机理：低剂量的γ射线诱发生物变异。高剂量γ射线使水分子电离，生成具有强氧化性的H+和强还原性的OH－，直接作用菌体细胞本身；电离产生的电子和环境的分子氧结合，氧化菌体内酶的化学基团使酶失活；辐射能导致DNA降解或其他物质分解，造成死亡。4.化学熏蒸（fumigating）灭菌法化学熏蒸的概念：在一定温度和压力的密闭条件下，化学毒剂由固态或液态迅速转成气态渗透到生物体内，使生物致死。常用熏蒸灭菌剂(1)甲醛（HCHO）R—NH2 + HCHO R—NH2 •CH2O甲醛的灭菌机理在于它的还原作用与蛋白质的氨基结合使其变性，从而破坏了酶系统和细胞膜、细胞壁的结构(2)环氧乙烷(CH2OCH2)R—SH + CH2OCH2 R—S—CH2CH2OH环氧乙烷的灭菌机理在于它与蛋白质的氨基、羟基、酚基和巯基结合使其变性，抑制氧化酶和脱氢酶的活性，破坏菌体正常代谢熏蒸设备：简易消毒箱、真空熏蒸机、熏蒸消毒室

高压电场脉冲灭菌技术 　高压电场脉冲灭菌是将食品置于两个电极间产生的瞬间高压电场中，由于高压电脉冲(HEEP)能破坏细菌的细胞膜，改变其通透性，从而杀死细胞。高压脉冲电场的获得有两种方法。一种是利用LC振荡电路原理，先用高压电源对一组电容器进行充电，将电容器与一个电感线圈及处理室的电极相连，电容器放电时产生的高频指数脉冲衰减波即加在两个电极上形成高压脉冲电场。由于LC电路放电极快，在几十至几百个微秒内即可以将电场能量释放完毕，利用自动控制装置，对LC振荡器电路进行连续的充电与放电，可以在几十毫秒内完成灭菌过程。另一种是利用特定的高频高压变压器来得到持续的高压脉冲电场。灭菌用的高压脉冲电场强度一般为15千伏／厘米～100千伏／厘米，脉冲频率为1kHz～100kHz，放电频率为1kHz～20kHz。高压电场脉冲灭菌一般在常温下进行，处理时间为几十毫秒，这种方法有两个特点：一是由于灭菌时间短，处理过程中的能量消耗远小于热处理法。二是由于在常温、常压下进行，处理后的食品与新鲜食品相比在物理性质、化学性质、营养成分上改变很小，风味、滋味无感觉出来的差异。而且灭菌效果明显，可达到商业无菌的要求，特别适用于热敏性食品，具有广阔的应用前景。脉冲强光灭菌技术 　　脉冲强光灭菌技术是采用强烈白光闪照的方法进行灭菌，它由一个动力单元和一个惰性气体灯单元组成。动力单元是一个能提供高电压高电流脉冲的部件，它为惰性气体灯提供能量，惰性气体灯能发出由紫外线至近红外区域的光线，其光谱与太阳光十分相近，但强度却强数千倍至数万倍，光脉冲宽度小于800μs。该技术由于只处理食品的表面，从而对食品的风味和营养成分影响很小，可用于延长以透明材料包装的食品及新鲜食品的货架期。研究表明，脉冲强光对枯草芽孢杆菌、酵母菌都有较强的致死效果，30余次闪照后，可使这些菌由105个减少到0个。脉冲强光起灭菌作用的波段可能为紫外线，但其它波段可能有协同作用。发态紫外光脉冲灭菌技术 　　这是近期开发的最具应用前景的灭菌技术之一。激发态紫外光脉冲灭菌技术不同于常规的物理灭菌手段，采用特制的光源和电源器件，在高频高压下产生单一波长253.7nm的紫外光，其强度可达到200mw／cm3以上，是常规紫外线装置发光强度的200倍～300倍，其脉冲可达到纳秒级，其能量足以打断细胞DNA结构中的C－H键、C－N键和O－H键，使DNA结构产生致死性损伤，如果和低浓度过氧化氢协同作用，不但可以增大灭菌强度，同样可以使残留的过氧化氢分解，这种新技术的应用将为无菌包装设备的微生物栅栏系统提供强有力的技术支持。 超高压灭菌技术 　　近年来，日本研制出一种新型的食品加工保藏技术，这就是超高压灭菌技术。超高压处理具有热处理及其它加工处理方法所没有的一些优点，可保持食品(如肉类等)原有的风味成分、营养价值和色泽，并杀死食品中常见的酵母菌、大肠杆菌、葡萄球菌等而达到灭菌目的。所谓高静压技术(HHP)就是将食品密封于弹性容器或置于无菌压力系统中(常以水或其他流体介质作为传递压力的媒介物)，在高静压(一般100MPa以上)下处理一段时间，以达到加工保藏的目的。在高压下，会使蛋白质和酶发生变性，微生物细胞核膜被压成许多小碎片和原生质等一起变成糊状，这种不可逆的变化即可造成微生物死亡。微生物的死亡遵循一级反应动力学。对于大多数非芽孢微生物，在室温、450MPa压力下的灭菌效果良好。芽孢菌孢子耐压，灭菌时需要更高的压力，而且往往要结合加热等其他处理才更有效。温度、介质等对食品超高压灭菌的模式和效果影响很大。间歇性重复高压处理是杀死耐压芽孢的良好方法。日本最新开发出的超高压灭菌机，操作压力达304MPa～507MPa。超高压灭菌的最大优越性在于它对食品中的风味物质、维生素C、色索等没有影响，营养成分损失很少，特别适用于果汁、果酱类、肉类等食品的灭菌，此外，采用300MPa～[font='Times New Roman'

培养基的高压灭菌及效果验证消毒灭菌在医学实践上有着重要意义。它可切断传播途径、控制感染扩散造成的危害；也可杀灭物品或器皿上的细菌，防止医院感染；在微生物检验的领域中，消毒灭菌是保正感染的病原学检验不受外来微生物污染的前提。（一）术语消毒( disinfection)、灭菌(sterilization)、抑菌(bacteriostasis)、防腐（antisepsis）和无菌( asepsis)是常用术语。下面就术语概念加以叙述。(1)灭菌：是用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去的方法。本法适用于制剂、原料、辅料及医疗器械等物品的灭菌。（如外科器械、注射器、基础培养基灭菌等。）(2)消毒：是破坏物体上活的病原微生物的方法，但不包括细菌芽胞和非病原微生物。如用酒精溶液浸泡体温计、新洁尔灭液擦拭检查台等。用于消毒的化学物品称消毒剂( dis-infectant)。一般而言，消毒对象是指物体而不是机体。(3)防腐：直接使用防腐剂(antiseptics)破坏或抑制活的病原微牛物的方法。如外科手术前碘液擦洗皮肤、双氧水清创伤口或杀菌肥皂清冼双手等。(4)无菌：防止感染病原体进入灭菌组织或物品的操作技术称无菌操作。无菌即为不存在活的微生物。用于消毒灭菌的物理方法有热力、电离辐射、超声波、过滤等。这里介绍热力消毒灭菌法。高热破坏微生物蛋白质、核酸、细胞壁和细胞膜，从而导致微生物死亡。受高热作用后，蛋白质分子运动加快，肽链连接键断裂，蛋白变性凝固；细胞膜功能受损使胞内物质漏出，细菌内外环境平衡失调。不同种类微生物对热的耐受力不同，多数无芽胞细菌经55-60℃作用30-60分钟后死亡，100℃时迅速死亡。有芽胞细菌则对高温有强的抵抗力，如肉毒芽胞梭菌煮沸需3—5小时才死亡。热力灭菌分干热灭菌法和湿热灭菌法两大类，相同温度下后者较前告效力大，其原因是：①湿热环境中菌体蛋白易凝固；②湿热穿透力比干热大；③湿热蒸气变为液态时可释放潜热，迅速提高被灭菌物体的温度。1．干热（dry heat）灭菌法(1)焚烧。直接点燃或在焚烧炉内进行，仅适用于废弃物品或动物尸体。(2)烧灼。直接以火焰灭菌，适用于微生物学实验室接种环、针和试管口等灭菌。(3)干烤。在干烤箱内进行，加热至150-180℃ 2-4小时达到灭菌效果，适用于高温下不变质、不被破坏和不蒸发的物品，如玻璃器皿、瓷器，不能用于塑料、棉、纸制品。2．湿热( moist heat)消毒灭菌法(1)巴氏消毒法。巴氏消毒法(pasteurization)是用较低温度杀灭液体中的病原微生物或特定微生物而保持物品中所需的不耐热成分的方法。此法由巴斯德创立，用于酒类消毒而得名。目前用于牛乳消毒。方法有两种：一种为71.6℃加热15秒，另一种为63-66℃加热30分钟。大多采用第一种方法。(2)煮沸法。在1个大气压下，水煮沸后温度达100℃，煮沸5分钟后可杀死一般细菌繁殖体。如于水中加入2%碳酸钠，可将其沸点提高至105℃，既可促进芽胞的杀灭，又可防止金属器皿生锈。(3)流通蒸气消毒法。又称常压蒸气消毒法，常用附诺(Amold)流通蒸气灭菌器，利用1个大气压下100℃水蒸气进行消毒，10-30分钟后细菌繁殖体被杀死，但对芽孢作用不大。(4)间歇灭菌法（fractional sterilization）。采用间歇方式达到灭菌目的。将灭菌物品置于阿诺流通蒸气灭菌器内，100℃加热15-30分钟，每日1次，连续3次。每次灭菌后取出物品置37℃孵育箱过夜，致残存的芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸气灭菌器加热而被杀灭。如此反复，既可杀灭芽胞，又可使不耐高温的物质免受影响。若某些物质不耐100摄氏度，则可将温度下降至75-80℃，每次加热时间延长到30-60分钟，常用血清凝固器对吕氏血清培养基和L-J培养基的灭菌属此方法。(5)高压蒸气火菌法。利用密闭的耐高压蒸气灭菌器(autoclave)，在蒸气不外溢的条件下，使锅内压力增高，随之蒸气温度也增高。通常在103.4kPa压力下蒸气温度达到121.3℃，维持15-20分钟，可杀灭所有的繁殖体和芽胞。本法适用于耐高温、耐湿物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、手术敷料等。（二）下向主要介绍高压蒸气灭菌器灭菌效果的验证方法高压蒸气灭菌器使物品灭菌后达到无菌要求，这是药品实验中的基本保证。高压灭菌器灭菌效果是否合格足实验成败的最基础最关键的首要步骤。除少数培养基只需加热溶解，不需高压灭菌外，大部分培养基均需121℃高压灭菌15-30分钟。尤其是对无菌试验培养基灭菌不彻底，直接关系到对药品的无菌试验结果。因此必须认真对高压灭菌器进行灭菌效果的验证。为此我们提供了进行灭菌效果验证的一个简易可行的方法。1．试验材料(1)嗜热脂肪芽胞杆菌纸片。嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)ATCC7053是本法常用的生物指示菌，含芽胞量5-lO5 CFU/片。(2) 121℃压力蒸气灭菌化学指示卡。(3)溴甲酚紫胨水培养基116℃高压灭菌20分钟后备用。(4)O—150℃留点温度计2．方法与结果将嗜热脂肪芽胞杆菌纸片（以下简称菌片）用无菌镊子放人密封试管中。化学指示卡和留点温度计放入敞口试管中。以上两种试管各准备5-10份。分别放置在高压灭菌器蒸气口处、底部排气口处及底部出水口处或上下左右中间5处。如灭菌器为二层，则需放10处。留点温度计标化合格后方可用于验证试验。检测前，需将温度计的水银柱甩至40℃以下。每次监测后留点温度计的温差应存l℃之间，则说明灭菌器内的温度分布是均匀的。灭菌后的菌片应在严格无菌操作条件下放入灭菌后的溴甲酚紫胨水培养基内56-60℃培养24-48小时，观察颜色变化。如培养基变为黄色，说明菌片中的嗜热脂肪芽胞杆菌尚未完全灭活，细菌仍可在培养基中生长，分解葡萄糖产酸变为黄色。如培养基颜色不变化仍为紫色，则说明芽胞已灭活。同时要用未经灭菌的纸片放入培养基内作为阳性对照，不加纸片的空白培养基作为阴性对照。化学指示卡上的指示色块，在高压蒸气灭菌时，由淡黄色变为黑色。随着颜色变化的深浅，并与对照色相比，可判断灭菌效果是否达到要求。化学指示卡应在干燥处保存。遇潮会变色，影响灭菌效果的观测。高压蒸气灭菌必须使蒸气顺利进入灭菌器内，与灭菌物品接触，并将原有的冷空气排出方可达到灭菌的效果。要进行空载热分布和满载热穿透力验证(满载时不超过总体积的2/3)。二种验证各重复三次，共做六次。5个点六次试验表明温度均在121℃，化学指示卡变黑；程度与对照色一致；培养基均未改变颜色，说明高压蒸气灭菌效果合格。高压灭菌器属于强检仪器，但强检只是对仪器物理参数的考核。所以做过强检的灭菌器还必须进行灭菌效果的验证。一些单位常常忽略了这个重要的问题。国内市售的手提灭菌器，往往仪器指针达到所需的温度，但灭菌物品的实际温度却未达到要求。导致灭菌物品不彻底，影响实验结果。培养基灭菌不彻底，影响培养基的使用及结果判断。因此高压蒸气灭菌器无菌效果的验证是一个必须引起重视的问题。（三）灭菌时的注意事项使用高压蒸气灭菌器时，首先应注意在开放蒸气的同时，排除灭菌器内的冷空气。必须将器内冷空气全部排除后，才可关闭排气孔。假如灭菌器内仍存留有部分空气时，刚压力表上虽已达到了某一压力值，但器内之温度仍未达到相应之度数。存留的空气越多，刚二者相差也越大。差也越大，器内温度不足，灭菌则不彻底。 转