艾滋病疫苗

Elispot在COVID-19新冠疫苗研发的应用—针对SARS-CoV-2治疗的戊糖磷酸途径研究显示：代谢紊乱与严重COVID-19的风险增加有关。COVID-19患者血清中葡萄糖含量的增加与患有和未患有糖尿病的个体预后不良相关（Shen 等人，2020 年）。在细胞水平上，SARS-CoV-2 诱导宿主细胞代谢向受感染细胞中的糖酵解转变，以及针对己糖激酶（糖酵解中的限速酶）的糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖 (2DG))，干扰结肠腺癌细胞 (Caco-2) 细胞和单核细胞中的 SARS-CoV-2 感染（Bojkova 等人，2020 年；Codo 等人，2020 年）。因此，拮抗病毒引起的宿主细胞代谢变化，尤其是糖酵解的药物是COVID-19治疗的候选药物。此次试验采用的是Elispot技术（酶联免疫斑点检测法），并通过Bioreader-7000-FzI (Bio-Sys) 对尖峰阳性区域进行定量。ELISPOT之于疫苗开发在新冠状病毒肆虐的当下，国内外针对新冠状病毒的疫苗研发正争分夺秒的进行，在疫苗效果评价中，有很多权威期刊文章中指出使用ELISPOT技术检测疫苗的细胞免疫功能是重要的技术手段并已得到广泛使用。中国药品生物制品检定所在 2003年发布的《预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指标原则》中明确指明：“使用ELISPOT方法检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能，作为检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方法”。此外，世界卫生组织在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，也推荐使用ELISPOT检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能（WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003）。ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）全名为酶联免疫斑点检测，是利用预先包被好抗原或抗体的微量板从单细胞水平检测特异性抗体分泌细胞或特异性细胞因子(cytokine,CK)分泌细胞的免疫学检测技术。1983年，Sedgwick和 Czerkinsky 等根据酶联免疫吸附试验(ELISA)的基本原理结合细胞培养技术，建立并首先报道了这种新技术，用于检测特异性抗体分泌细胞。1988 年该方法被首次用于检测 IFN-γ分泌细胞。简单来说，就是用在PVDF 膜为底的孔板上包被好的抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其呈现出来。ELISPOT技术的基本步骤为:(1) 用抗待检细胞因子的高亲和力的单克隆抗体包被96孔板,然后用1%牛血清蛋白37℃封闭2 h, 阻止非特异性蛋白的吸附。(2) 将细胞和刺激剂加到孔中孵育一段时间, 此时活化细胞分泌细胞因子。(3) 洗去多余的细胞。(4) 加入生物素标记的检测抗体。(5) 加入酶标记的链亲和素, 加入底物溶液显色检测抗体细胞因子复合物。数据检测和分析通过显色反应，在细胞分泌可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可使用BIO-SYS Bioreader对斑点进行计数，进行高通量筛选，检测效率远远高于其它方法。关于BIO-SYS\Bioreader由德国BIO-SYS有限公司研制，拥有专利的双远心照明系统，通过使用“光度”强度照明和梯度来区分真/假点。实验结果输出：参考文献：Bojkova D, Costa R, Reus P, Bechtel M, Jaboreck MC, Olmer R, Martin U, Ciesek S, Michaelis M, Cinatl J Jr. Targeting the Pentose Phosphate Pathway for SARS-CoV-2 Therapy. Metabolites. 2021 Oct 13 11(10):699. doi: 10.3390/metabo11100699. PMID: 34677415 PMCID: PMC8540749.

多功能清创机QC-1P型(犬咬伤清创机)采用脉动压力技术，使用无线冲洗枪+特制枪头，采用无菌包装的 益涟茗 弱碱性皮肤黏膜消毒剂，通过自动化控制程序全自动完成高标准的犬伤冲洗处置。1、全自动控制系统整套控制系统以国家规范为框架，以 伤患的安全为目标控制，一键开启即可自动完成 一次标准的犬伤冲洗流程，甚至轻伤 患完全可轻松完成自助冲洗。 整个冲洗过程中水温、水压、犬清 弱碱性皮肤黏膜消毒液与清水的交替 冲洗、生理盐水冲洗都会自动完成结束时的小票打印等自动完成，并会作出语音提示，无需做其他任何操作针对重伤患、大面积撕裂伤患等特有 手动功能，专业人员可根据情况选择冲洗方式（手动模式同样有程 序辅助，极大降低医护人员工作负担）。2、高频脉冲灌冲频脉动灌冲高频脉动灌冲压力水柱结合间歇性的大量水泡瞬间爆裂的冲击，共同作用在冲洗创面，使创口组织规律的收缩舒张，使创面缝隙中的破碎组织、杂质、病毒、细菌被翻动冲出。显著降低患者疼痛阈值，不破坏健康组织，冲洗工作安全高效。脉动压力压强56kPa,频率每分钟900~1800次，安全快速，不会造成清创部位组织水肿。3、多功能冲洗枪功能冲洗枪无线控制，枪不离手进行启停控制无线控制，枪不离手进行启停控制，方便没有累赘的电源线、控制线等，减少故障概率。针对不同类型的创口，特别研制了多种场景的特制枪头，以保障犬伤清创冲洗的安全高效。例如针对大面积撕裂伤特有扇面型枪头；针对开口小，创伤深的伤口有精细枪头可对深创面做全面灌注型冲洗。国内现状：“我国养犬数量超过一亿，每年因犬咬伤而注射狂犬病疫苗的超过1200万人。每年老百姓的狂犬病疫苗免疫和免疫球蛋白支出就超过50亿元。”-------狂犬病专家、军事科学院军事医学研究院-- 涂长春法定报告传染病中狂犬病死亡人数仅次于艾滋病和肺结核；狂犬病疫苗每年的批签1,200-1,600 万人份，位列国内前20 大产值疫苗品种榜首，遥遥先于其他疫苗使用市场。-------摘自《中国狂犬疫苗市场调研与投资研究报告》中国宠物行业规模在2017 年达到1,340亿元，在2015 年至2025 年期间将保持年均30.9%的高增速发展，但同时多地市犬伤门诊量每年增长也在20%以上。---------《中国宠物行业白皮书》1、专业①犬伤清创机取得《医疗器械注册证》，型号：QC-1P②冲洗报告、自动记录、打印并签字确认，严格避免医疗事故，杜绝医患纠纷！2、有效① 临床试验报告均证实了清创机的有效性。②《益涟茗》弱碱性皮肤黏膜清洗剂、《益涟茗》消毒喷剂含有葡萄糖酸氯己定、表面活性成分，杀毒，无刺激、还可8小时长效抑菌，有效降低犬伤并发感染和继发细菌感染率。3、便捷①一键自动冲洗、清单自动打印，记录自动保存、统计，枪柄无线控制压力，解放门诊人力物力！②带快捷接口的《益涟茗》弱碱性皮肤黏膜消毒液+《益涟茗》消毒喷剂，免去配皂液、涂碘伏等繁琐的流程，安全又高效！③推车式设计，自由移动，不受使用场景、环境、场地的限制！QC-1P医用创口冲洗机采用脉动压力技术，使用特制刀头，采用无菌包装的-犬清TM-弱碱性皮肤黏膜消毒液，通过自动化控制程序全自动完成高标准的犬伤冲洗处置。蓝茗医疗QC-1P犬伤清创机科学的处置能有效减低伤患创口病毒数量，极大提升狂犬病预防有效性；以完全符合国家规定的处置程序有效保障犬伤门诊的权益，规避医疗风险，避免医疗纠纷；专业的冲洗清创设备可显著降低对门诊处置水平要求，减轻处置人员的工作负担。 产品原理 多功能清创机QC-1P型(犬咬伤清创机)采用脉动压力技术，使用无线冲洗枪+特制枪头，采用无菌包装的 益涟茗 弱碱性皮肤黏膜消毒剂，通过自动化控制程序全自动完成高标准的犬伤冲洗处置。1、全自动控制系统整套控制系统以国家规范为框架，以 伤患的安全为目标，的控制，一键开启即可自动完成 一次标准的犬伤冲洗流程，甚至轻伤 患完全可轻松完成自助冲洗。 整个冲洗过程中水温、水压、犬清 弱碱性皮肤黏膜消毒液与清水的交替 冲洗、生理盐水的后冲洗都会自动完成结束时的小票打印等自动完成，并会作出语音提示，无需做其他任何操作针对重伤患、大面积撕裂伤患等特有 手动功能，专业人员可根据情况选择优的冲洗方式（手动模式同样有程 序辅助，极大降低医护人员工作负担）。2、高频脉冲灌冲频脉动灌冲高频脉动灌冲压力水柱结合间歇性的大量水泡瞬间爆裂的冲击，共同作用在冲洗创面，使创口组织规律的收缩舒张，使创面缝隙中的破碎组织、杂质、病毒、细菌被翻动冲出。显著降低患者疼痛阈值，不破坏健康组织，冲洗工作安全高效。脉动压力大压强56kPa,频率每分钟900~1800次，安全快速，不会造成清创部位组织水肿。3、多功能冲洗枪功能冲洗枪无线控制，枪不离手进行启停控制无线控制，枪不离手进行启停控制，方便没有累赘的电源线、控制线等，减少故障概率。针对不同类型的创口，特别研制了多种场景的特制枪头，以保障犬伤清创冲洗的安全高效。例如针对大面积撕裂伤特有扇面型枪头；针对开口小，创伤深的伤口有精细枪头可对深创面做全面灌注型冲洗。

酶联免疫斑点技术(Enzyme Linked Immunospot Assay,ELlSPOT)是细胞免疫学研究中最敏感的检测方法之一，可以在单细做水平对抗体分泌细胞（ASC）及细胞因子（CK）分泌细胞进行检测。由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比ELISA和有限稀释法等具有更高的灵敏性。能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。并且该方法能够对抗原刺激后的活细验进行功能性检测，具有较高的特异性、直观可信度高，并且易操作，已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中，在国内外免疫学界获得了广泛的应用。AID EliSpot Reader Classic酶联免疫斑点分析仪 德国艾迪（AID）是全球领先的专业研发并生产酶联斑点分析仪的厂商，最早在全球上市酶联斑点分析仪，自AID EliSpot Reader上市以来，已经有超过1500多家实验室正在使用AID的EliSpot Reader- 酶联免疫斑点分析仪。 AID EliSpot Reader硬件和软件完全符合欧盟CE 认证，FDA 21CFR part11规范、GMP/GLP标准。 AID EliSpot Reader Classic 主要配置：&bull 德国制造高分辨率科研级别相机，彩色CCD芯片，清晰捕捉微小斑点&bull QuadPack高精度电动载物台：全自动控制，精确位移，各孔自动居中&bull LED环形无影照明光源：照射均匀，可清晰分辨因孔侧壁反光造成的幻影现象，准确识别孔底边缘&bull 专业水准的电动光学镜头：镜头自动聚焦，自动曝光调节，保证清晰捕捉微小斑点&bull 独立高配置计算机系统：与分析仪独立，有效减少故障率，预装正版Win7及Office软件等&bull ELISPOT软件：全自动读板，自动计数分析；同步完成斑点图像扫描、斑点计数与结果分析； AID EliSpot Reader 软件功能： 斑点图像采集与计数：全自动读板，自动采集各孔图像；自动计算斑点数量和斑点相关信息如大小、面积、光密度等。内置不同因子参数设置，直接调用；CountAID 功能协助优化读数参数，并具有智能参数记忆功能。 结果分析：直接判断阴阳性检测结果；诊断模块AIDiagnostic，适用于临床诊断用ELISPOT实验的结果判读，单独输出每例病人斑点图像和结果报告；统计分析各孔斑点分布、对比免疫反应强弱、细胞因子分泌量化比较等。 数据输出与质控：可输出单孔图像、任意孔及整板图像；多种保存格式，Excel, Txt, PPT等；输出数据可自定义包含斑点数,SFU,光密度强度, Activities，斑点分布图表等；包含质控模块，操作历史自动记录，符合GLP规范。 Applications - 酶标ELISPOT应用文献 :Science 1998, 279: Quantitation of HIV-1–Specific Cytotoxic T Lymphocytes and Plasma Load of Viral RNA.Graham S.Ogg, Xia Jin,et al.Science 1998, 281: Identification of LFA-1 as a candidate autoantigen in treatment-resistant Lyme-Arthritis. Gross DM, et al.Nature 2005,433,887-892.Toll-like receptor 3 promotes crosspriming to virus-infected cells. Oliver Schulz1*,et al.Lancet 2005, 366: 1443-1451. Effect of BCG vaccination on risk of Mycobacterium tuberculosis infection in children with householdtuberculosis contact: a prospective community-based study. Ahmet Soysal,et al.Lancet 2003 Apr 5 361(9364):1168-73. Comparison of T-cell-based assay with tuberculin skin test for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection in a school tuberculosis outbreak. Ewer K, et al.Blood 2009,114: 4089-4098. Interleukin-21 restores immunoglobulin production ex vivo in patients with common variable immunodeficiency and selective IgA deficiency. Stephan Borte, et al. AID iSpot Reader荧光酶联免疫斑点分析仪（可见光/荧光双重检测功能的ELISPOT分析仪） AID iSpot Reader 主要配置：&bull 德国制造光学系统高分辨率科研级别相机，彩色CCD芯片，高品质成像，保证微小斑点及斑点晕的识别&bull 专业水准的电动光学镜头：镜头自动对焦，自动曝光调节，保证清晰捕捉微小斑点&bull 荧光照明系统：高能氙灯，激发效率高，波谱范围广250-1000nm，是最适合荧光成像的激发光源&bull 4-8位滤光片轮，全自动切换，至少标配FITC和Cy3荧光滤光片，其他波长可加配&bull 独立高配计算机系统：与分析仪独立有效减少故障率，配置实时更新&bull ELISPOT软件：全自动读板，自动计数分析；自动叠加不同荧光通道图像，找出共染色斑点（共分泌细胞） AID iSpot Reader 专利的软件功能及技术先进性： 专利的荧光图像Overlay技术保证多色因子共分泌斑点准确识别， 避免酶标双色检测中因不同细胞因子分泌量不均而引起的误判 全自动判读：iSpot对板上每孔的各种颜色荧光斑点分别成像，例如 检测FITC标记的IFN-γ分泌情况和Cy3标记的IL-2分泌情况，软件再自行将不同荧光图像叠加（Overlay），准确识别共分泌（IFN-γ&IL-2）细胞。整个过程全自动，无需人工干预；性能稳定, 兼容扩展性好：高能激发保证微弱荧光信号检测，窄带滤光片保证特异性信号检测，多色扩展只需加配滤光片；技术先进性：最早在全球上市酶联斑点分析仪，1996年发明《应用Elispot方法检测血液细胞活性》的专利；唯一拥有《以荧光滤光片为基础进行荧光多色ELISPOT的检测系统》的专利PCT/EP2008/009112‐FluoroAID；学术发表权威性：从荧光款2007年上市到现在，80% 荧光EliSpot应用SCI文献是由 发表的，被公认作荧光检测的最佳选择 ；国际认可度高：与牛津大学Oxford免疫学实验室密切合作开发是其用于结核的酶联斑点(T-Spot)诊断的专用工具；国际艾滋病、疫苗行动组织（IAVI）指定品牌；全球知名Elispot试剂盒开发实验室（如瑞典Mabtech）专用品牌。 Applications - 荧光ELISPOT应用文献 :Nature Medicine. 2013 Oct 19(10):1305-13. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza.Saranya Sridhar, &Ajit Lalvani,et al.Infection, 2014 Jan. IGRA-positive patients and interferon-gamma/interleukin-2 signatures: Can the FluoroSpot assay provide further information? P. Bittel, et al.Journal of internal medicine, 2013. Decreased functional T lymphocyte-mediated cytokine response in patients withchemotherapy-induced neutropenia. ?hrmalm L., et al.Methods Mol Biol. 2012 792:77-85. Dual- and triple-color fluorospot. Ahlborg N, Axelsson B.ELISPOT 应用领域(Application):免疫学基础研究：T细胞和B细胞，Th0/Th1/Th2细胞转换分析疫苗研究：ELISPOT是检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方法。国际上普遍采用ELISPOT方法监测HIV疫苗研究中的免疫应答反应，在国际艾滋病疫苗行动计划中，采用ELISPOT法对T细胞功能进行评价。药物筛选：化合物和药物免疫学反应的筛选感染性疾病诊断与研究：例如结核病的临床诊断，莱姆病、艾滋病等传染病的研究肿瘤免疫研究：已用于分析和评价在癌症病人中诱导肿瘤特异的T细胞的疫苗试验。治疗前后特异性细胞免疫应答水平的检测，可有效的评估治疗效果，对于治疗和用药提供重要的参考信息。自身免疫病研究：调整机体免疫调节功能，对自身免疫病的治疗揭供更有效的措施过敏研究：参与过敏机制的细胞因子研究，如IL-4移植免疫研究：移植中排斥反应的预测