双特异性抗体

p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 1、双特性抗体简介 /strong /span br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 双特异性抗体（BsAb）又称双功能抗体，可同时识别和结合两种不同的抗原和表位，并阻断两种不同的信号通路以发挥其作用。根据不同结构可将双特异性抗体结构主要有2大类：含Fc片段的双特异性抗体（IgG-like双特异性抗体）与不含Fc片段的双特异性抗体（non-IgG-like双特异性抗体）。 /p p style=" text-indent: 2em " strong IgG-like双特异性抗体 /strong ：IgG样BsAb有Fc部分，具有Fc介导的效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（CDC）和抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用（ADCP）。分子量相对较大，其Fc部分有助于抗体后期的纯化并提高其溶解性、稳定性。IgG样BsAb相对分子量较大，且Fc部分与受体FcRn结合，增加了抗体血清半衰期。此类抗体结构主要包括Triomabs/quadroma、DVD-Ig（dual variable domain Ig）、CrossMAb、Two-in-one IgG、scFv2-Fc。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/cd9bb872-271d-45cb-afbc-35f7cba5588c.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 双特异性抗体（BsAb）又称双功能抗体，可同时识别和结合两种不同的抗原和表位，并阻断两种不同的信号通路以发挥其作用。根据不同结构可将双特异性抗体结构主要有2大类：含Fc片段的双特异性抗体（IgG-like双特异性抗体）与不含Fc片段的双特异性抗体（non-IgG-like双特异性抗体）。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong non-IgG-like双特异性抗体： /strong 非IgG样BsAb缺乏Fc片段，仅通过抗原结合力发挥治疗作用，具有较低的免疫原性、易于生产、分子量小等特点。因相对分子量较小，其在肿瘤组织的渗透性较高，因此具有更强的治疗效果。这些BsAb有诸多形式，主要包括TandAb（tandem diabody）、scFv-HSA-scFv、BiTE（bi-specific T-cell engager）、DART（dual affinity retargeting）、Nanobody。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/9acc75b7-4909-447c-adaf-5781ed723f89.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" / /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 2、双特异性抗体的临床优势 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " BsAb与普通抗体相比增加了一个特异性抗原结合位点，在治疗方面表现出了以下优势： /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √ 介导免疫细胞对肿瘤的杀伤 /strong ：双特异性抗体的一个重要作用机制是介导免疫细胞杀伤，双特异性抗体有两条抗原结合臂，其中一条与靶抗原结合，另一条与效应细胞上的标记抗原结合，后者可以激活效应细胞，使其靶向杀伤肿瘤细胞。目前已经批准上市的2个双特异性抗体产品都属于这个类别，Trion Pharma公司开发的catumaxomab能够靶向肿瘤表面抗原EpCAM和T细胞表面受体CD3，而Micromet公司和Amgen公司开发的Blinatumomab可以同时结合CD19和CD3。两者都是通过激活并召集杀伤性T细胞，从而达到治疗肿瘤的目的； /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/f2b9023b-cc8d-488f-92f5-4a2013fa0fd8.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √& nbsp 双靶点信号阻断，发挥独特的或重叠的功能，有效防止耐药： /strong 同时结合双靶点，阻断双信号通路是双特异性抗体的另一个重要作用机制。受体络氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）是最大的一类酶联受体，在细胞增殖过程中发挥重要的调节作用，如Her家族等。RTKs在肿瘤细胞表面异常高表达，导致肿瘤细胞恶性增生，因此也是肿瘤治疗的重要靶点。针对RTKs的单靶点单克隆抗体已在肿瘤治疗中得到广泛应用，但是，肿瘤细胞可以通过转换信号通路或通过HER家族成员自身或不同成员之间的同源或异源二聚体激活细胞内信号进行免疫逃逸。因此采用双特异性抗体药物同时阻断两个或多个RTKs或其配体，可以减少肿瘤细胞逃逸，提高治疗效果； /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √& nbsp 具备更强特异性、靶向性和降低脱靶毒性： /strong 利用双特异性抗体两个抗原结合臂可以结合不同抗原的特点，两个抗原结合臂分别结合癌细胞表面2种抗原，可以有效增强抗体对癌细胞的结合特异性和靶向性，降低脱靶等副作用； br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √& nbsp 有效降低治疗成本： /strong 以BiTE为例，与传统抗体相比在组织渗透率、杀伤肿瘤细胞效率、脱靶率和临床适应症等指标方面都具有较强的竞争力，临床优势显著。特别在使用剂量方面，由于其治疗效果可以达到普通抗体的100-1000倍，使用剂量最低可将为原来的1/2000，显著降低药物治疗成本。相对于组合疗法，双特异性抗体的成本也远远低于两个单药联合治疗。 br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 双特异性抗体的制备主要有双杂交瘤细胞法，化学偶联，重组基因制备等方法。重组DNA技术是目前制备BsAb使用最多的技术。 /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 3、双特异性抗体的制备方法 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 双特异性抗体的制备主要有双杂交瘤细胞法，化学偶联，重组基因制备等方法。重组DNA技术是目前制备BsAb使用最多的技术。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √& nbsp 化学偶联法： /strong 该方法最早出现于上世纪80年代，其原理是通过化学偶联剂（如邻苯二马来酰亚胺、N-琥珀酰-3-（2-吡啶二硫基）丙酸盐、二硫代酰基苯甲酸等）将两个完整IgG或两个F(ab)2抗体片段偶联成一种BsAb，这种方法快速简便，但是容易破坏抗原结合部位从而影响抗体活性，同时交联剂本身的安全性和致癌性不确定； /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √& nbsp 双杂交瘤融合法： /strong 通过细胞融合的方法将2株不同的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞株，然后通过常规的杂交瘤筛选法克隆靶细胞。由于双杂交瘤的遗传背景来源于亲代的两种杂交瘤细胞，它必然要产生2种重链和2种轻链分子，而这些轻重链的随机组合配对方式才能产生所需的BsAb.利用双杂交瘤方法制备双特异性抗体随机性较大，效率低，但是BsAb生物活性较好，抗体结构比较稳定。利用Konck-in-hole技术可以有效解决异源抗体抗体重链正确配对的难题。制备方法是将一个抗体的重链CH3区366位体积较小的苏氨酸突变为体积较大的络氨酸，形成突出的“杵”型结构；将另一个抗体重链CH3区407位较大的络氨酸残基突变成较小的苏氨酸，形成凹陷的“臼”型结构；利用“杵臼”结构的空间位阻效应实现两种不同抗体重链间的正确装配。化学偶联法和双杂交瘤融合法生产出的双特异性抗体为鼠源性，具有较强的免疫原性，且产量低纯度差，在临床应用上有很大的制约； br/ /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/1c866bc3-af96-4ab1-919d-6adc354c4247.jpg" title=" 4.jpg" alt=" 4.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong √& nbsp 基因工程： /strong 利用基因工程技术制备双特异性抗体是目前最常用的制备方法，其制备原理为利用基因工程技术对传统抗体进行基因工程方面的改造，从而形成多种形式的双特性抗体。 br/ /p p style=" text-align: justify " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 4、双特性抗体在肿瘤治疗中的研发现状 /strong /span /p p style=" text-align: justify " strong Catumaxomab /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " Catumaxomab（Removab，Trion）于2009年正式获得EMA批准在欧洲上市，用于治疗恶性腹水（腹腔转移癌晚期患者常见的一种并发症），成为全球第一个上市的双特异性抗体。在II / III期研究中，腹膜内catumaxomab改善了无穿刺存活率和下次腹腔穿刺的中位时间，减少了腹水的体征和症状，并显示出改善OS的趋势。 最常见的不良反应是发热，恶心，呕吐和腹痛。目前正在进行的临床试验包括卵巢癌、胃癌和上皮癌。Catumaxomab是一个分子量在150kDa三功能的抗体，由一个靶向肿瘤EpCAM的小鼠IgG2a和一个靶向CD3ε的大鼠IgG2b构成，同时还能通过Fcγ受体激活单核细胞、巨噬细胞、星状细胞以及NK细胞。由于小鼠和大鼠的轻重链之间很少发生错配，通过quadroma（hybrid-hybridoma）的方式，将分别表达小鼠和大鼠抗体的杂交瘤进行二次融合，从而得到同事分泌Triomab双特异性抗体以及小鼠和大鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株。然后在通过亲和力纯化的方式、分别去除小鼠和大鼠单克隆抗体。虽然Catumaxomab是第一个批准上市的双特异性抗体，但同时也具有非常明显的局限性，主要体现在Triomab抗体复杂的生产工艺以及异源抗体比较容易产生的免疫原性问题。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/e30a7448-be1a-4ee1-a003-2d0a8e910074.jpg" title=" 5.jpg" alt=" 5.jpg" / /p p strong Blinatumomab（博纳吐单抗） /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " Blinatumomab于2014年12月4日获得美国FDA批准，用于治疗费氏染色体阴性的前体B细胞急性淋巴细胞白血病。Blinatumomab由Micromet公司（后被Amgen公司收购）开发，是利用DNA重组技术制备的一种双特异性的单链抗体BiTE，通过一条多肽链把靶向肿瘤细胞和T细胞表面抗原的两种单克隆抗体的可变区连接起来，Blinatumomab选择性地靶向B细胞表面抗原CD19，同时特异性地结合T细胞表面抗原CD3从而激活T细胞。因为主要由两条单链抗体连接而成，BiTE的分子量较小（55-60kDa），容易渗透肿瘤组织。同时BiTE缺乏Fc段因而免疫源性较低。临床试验已经证明Blinatumomab即便在很低的使用剂量下，依然可以有效召集T细胞并清除肿瘤，显着改善复发或难治性B细胞前体ALL患者的中位OS。 其常见的不良反应包括发热，头痛，发热性中性粒细胞减少和外周性水肿。但是由于没有Fc片段，BiTE抗体分子的体内半衰期很短，试剂使用的时候需要额外配备连续输液装置。2017年Blinatumomab全球销售达1.75亿美元（2014年300万美元、2015年0.77亿美元、2016年1.15亿美元）。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/25849992-832f-4ea8-8403-4b0326c9455a.jpg" title=" 6.jpg" alt=" 6.jpg" / /p p strong 其他在研双特异性抗体 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 目前有多个双特异性抗体正在开展用于治疗肿瘤的临床试验，其结构中多包含CD3抗原结合位点（用于募集T细胞到肿瘤细胞附近），另一个结合位点包括CD19,CD20,CD33,CD123,HER2,CEA，神经节苷脂GD2，PSMA，gpA33等等。另外，还有一些双特异性抗体为：HER2 + HER3, IL1α+IL1β,IL13+IL17, IL17A/IL17F和CD30+CD16A。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/65a7606a-7037-4841-bb6c-51b9ddccfe40.jpg" title=" 7.jpg" alt=" 7.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 部分终止临床的双特异性抗体： /strong 在进入临床用于治疗肿瘤的双特异性抗体中，共有8个临床试验被终止。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/214002fa-5ac5-4e25-a649-06403b0bcffd.jpg" title=" 8.jpg" alt=" 8.jpg" / /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 5、国内双特异性抗体研发企业 /strong /span /p p style=" text-indent: 2em " span style=" text-align: justify " 据不完全统计，国内目前从事双特异性抗体研发的企业共有19家，其中上市公司3家，分别为珠海丽珠、江苏恒瑞、浙江海正药业，非上市公司16家，分别为武汉友芝友（石药占股40%）、武汉中美华世通、苏州康宁 /span span style=" text-align: justify " 杰瑞、苏州信达、苏州天演药业、苏州博生吉（安科生物占股20%）、上海君实生物、上海复宏汉霖（复星医药子公司）、上海岸迈生物、上海健能隆（合肥亿帆子公司）、上海宜明昂科、北京康众生物、北京天广实、深圳本康生物、中山康方生物、杭州特瑞思。 /span br/ /p p style=" text-align: justify " strong 武汉友芝友： /strong 友芝友是一家专门从事生物医药自主创新研发的高科技企业。从团队上讲，友芝友是一个由院士领衔，制药巨头研发高管参与的国际化背景团队。CDE的数据显示，友芝友自主开发的“注射用重组抗HER2和CD3人源化双特异性抗体”(M802)和“注射用重组抗EpCAM和CD3人鼠嵌合双特异性抗体”（M701），分别于2017年9月29日和2018年3月6日获得临床批件。 /p p style=" text-align: justify " strong 武汉中美华世通： /strong 中美华世通成立于2009年，由“国家千人计划”专家张发明博士回国创立。其子公司杭州翰思生物致力于肿瘤免疫领域生物大分子的研发及产业化，自主研发的PD-1目前已在进入国内二期临床。临床前品种围绕PD-1布局多个双特异性抗体，包括PD-1/CD47,PD-1/IL-10,PD-1/VEGF,CD47/VEGF等等，其中PD-1/CD47（HX009）目前已完成中试，正在猴子体内进行长毒试验，预计明年中获得临床批件。 br/ /p p strong style=" text-align: justify " 苏州康宁杰瑞： /strong span style=" text-align: justify " CRIB（Charge Repulsion Improved Bispecific）是康宁杰瑞自主研发的双特异性抗体平台，基于完整的抗体框架结构，通过有针对性的调整不同Fc链之间的电荷网络分布，大大增加异二聚体形成的几率的同时，阻碍同二聚体的形成，从而达到构建双特异性抗体分子的目的。目前康宁杰瑞的研发的“注射用重 /span span style=" text-align: justify " 组人源化抗HER2双特异性抗体”已于2018年4月10号获得临床批件，另外还有多个双特异抗体处于临床前研究。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 苏州信达生物： /strong span style=" text-align: justify " 信达生物制药致力于做国内最好、国际一流的高端生物制药公司。在双特异性抗体领域，信达生物与岸迈生物、礼来达成合作协 /span span style=" text-align: justify " 议，获得岸迈生物的FIT-Ig平台技术的全球权益，开发包括IBI302在内的双靶点单克隆抗体注射液。IBI302可用于治疗多种眼底黄斑疾病和实体瘤，通过同时阻断疾病发生和发展过程中的两个靶点，达到标本兼治的效果，显著优于现有治疗水平。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 苏州天演药业： /strong span style=" text-align: justify " 天演药业成立于2012年，致力于开发新一代治疗性和诊断用抗体技术的生物制药公司。公司的药物筛选平台“动态高精度抗体技术”突破了生物抗体药物研发面临的两大瓶颈：如何扩展治疗性抗体的靶向空间和如何提高抗体药物开发的成药性。目前，天演药业已经建立了高质量的、多样性达千亿的可开发性抗体库，能精准地设计 /span span style=" text-align: justify " 、构建及筛选治疗性抗体，并能生成针对不同靶点的单特异性与双特异性抗体，包括传统上难以生成抗体的复杂靶点的但特异性及双特异型抗体产品线。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 苏州博生吉： /strong span style=" text-align: justify " 博生吉医药以肿瘤细胞免疫治疗技术与产品为主要发展目标、以临床技术服务为主要业务的高科技企业。博生吉以细胞疗法为主，但在双特 /span span style=" text-align: justify " 异性抗体方面也崭露头角，公司研发的针对多发性骨髓瘤的CD3/CD138 BiTE在细胞水平上展现了骨髓瘤细胞的杀伤作用。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 上海君实生物： /strong span style=" text-align: justify " 君实生物是一家以开发治疗性抗体为主的研发型高科技公司，专注于创新单克隆抗体药物和其他治疗性蛋白药物的研发与产业化，已搭 /span span style=" text-align: justify " 建国内一流创新人源化抗体药物产品研究开发技术平台。该平台涵盖分子抗体药物筛选、高产稳定CHO细胞株的构建及治疗性抗体分析检测在内的多个核心技术。公司旗下目前在研的双特异型抗体候选药物主要有两款：创新性人源化JS005双特异抗体注射液、创新型人源化JS003双特异抗体注射剂。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 上海复宏汉霖： /strong span style=" text-align: justify " 复宏汉霖由复星医药与美国科学家团队于2009年12月合资组建，公司主要致力于应用前沿技术进行单克隆抗体生物类似 /span span style=" text-align: justify " 药、生物改良药以及创新单抗的研发及产业化。目前，复宏汉霖有14个单抗药物处于在研阶段，其中双特异性抗体药物两个（HLX31、HLX32）。 /span br/ /p p strong 上海岸迈生物： /strong 岸迈生物成立于2016年，主要关注肿瘤领域的双特异性抗体研发。岸迈生物的核心技术是双特异性抗体研发平台FIT-lg，FIT-Ig是一项新型的构建双特异性抗体的技术平台，保留了单克隆抗体的主要基本结构元素及生物学特性，同时可以结合及抑制两种不同的致病因子(靶源)，并且该项技术已经通过了对产品的可药性和产业化规模生产的验证。目前公司正全力将现有产品向临床推进，预计第一个产品将于2018年进入临床试验阶段。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/34f5b2cf-de66-47c6-b113-b1ea83dfd5f5.jpg" title=" 11.jpg" alt=" 11.jpg" / /p p style=" text-align: justify " strong 上海健能隆： /strong 健能隆医药建立了免疫抗体技术平台ITabTM（Immunotherapy Antibodies），启动了一系列双特异性抗体药物的开发，用于多种实体瘤和血液肿瘤的免疫治疗。利用该技术凭条设计合成的双特异性抗体分子具有独特的结构特征，可在真核细胞中表达，易于大规模生产。 /p p strong style=" text-align: justify " 上海宜明昂科： /strong span style=" text-align: justify " 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司创立于2015年6月， 致力于肿瘤的免疫治疗产品的开发研究，在研产品包括针对免疫调节靶 /span span style=" text-align: justify " 点的单克隆抗体、经过武装的靶点特异性NK细胞以及双特性性抗体。公司针对CD47靶点的单抗已于2018年9月1日获得NMPA临床试验研究受理。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 北京康众生物： /strong span style=" text-align: justify " 康众生物的肿瘤T细胞生物治疗技术平台，基于其独创的羊驼纳米抗体快速分离技术，用于重点研发纳米抗体双特异性抗体（nano /span span style=" text-align: justify " BiTE）。BiTE(Bispecific T-cell engager)技术是采用DNA重组技术将识别T细胞的CD3抗体与其它抗体的重链和轻链可变区通过连接肽连接形成单一的双特异性抗体，这种抗体能够介导T细胞和靶细胞之间形成溶细胞行免疫连接，有效杀伤肿瘤细胞。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 北京天广实： /strong span style=" text-align: justify " 是一家处于临床阶段的生物制药公司，具备国内领先的单抗药物研发和产业化技术能力并形成了完善的技术体系。根据CDE的数据显示，公司的“注射用重组人源化双功能单克隆抗体MBS301（HER2-D2/D4） /span span style=" text-align: justify " ”已于2018年8月27日获得临床批件。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 深圳本康生物： /strong span style=" text-align: justify " 成立于2015年，主要从事生物制药和细胞治疗创新工具和技术解决方案的开发。公司技术团队中不乏出自安进、拜耳这些巨头公司的研发人才，依托公司在蛋白质工程领域多年的研究经验，公司储备了大量有望改造和提升细胞治疗技术的工具，涵盖双特异性抗体药物开发、细胞培养方案及基于磁珠的细胞分离技术以及细胞检测等诸多方面。目前一共有5个双特异性抗体药物，其中有三个正在展开临床试验，除了一项是在美国申报以外，其他两项试验尚未公布申报地点。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 中山康方生物： /strong span style=" text-align: justify " AK-104是中山康方生物医药开发的一种双特异性抗体，同时靶向于CTLA-4和PD-1。CTLA-4和PD-1是在肿瘤浸润淋巴T细胞上共表达的免疫检查点蛋白，康方研发的AK104能同时阻断这两个通路。AK-104目前已在澳大利亚启动了临床一期试验，用于治疗晚期实体瘤。中山康方生物医药已于2017年11月向CFDA药品审评中心递交了该药的新药临床试验(IND)申请。 /span br/ /p p strong style=" text-align: justify " 杭州特瑞思： /strong span style=" text-align: justify " 特瑞思是由国家“千人计划”专家吴幼玲博士领导的海外归国精英联合浙江民营企业家创立的，是一家集研发、中试放大和商业化生产、销售为一体的创新生物制药企业。公司拥有丰富的产品管线，其中2个双特异性抗体处于临床前研究，分别是TRS008（治疗非小细胞肺癌、尿路上皮癌）、TRS009（治疗肺癌、黑色素瘤、膀胱癌，消化道肿瘤）。TRS008是特瑞思于2018年4月与上海岸迈生物合作引进的品种，浙江特瑞思该药的中国市场开发权益,岸迈生物将保留该项目除中国以外的全球商业权益。 /span br/ /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 6、结语 /strong /span /p p style=" text-align: justify " 双特异性抗体是抗体药物领域最新的一个概念，被视为治疗肿瘤的第二代抗体疗法。国内虽然有多家企业布局双特抗体领域，但多处于临床前研发状态，进入临床阶段仅有武汉友芝友、苏州康宁杰瑞、北京天广实等几家企业。作为一种前瞻技术，其在产业化面临诸多挑战，如解决错配和纯化，改善下游工艺不稳定，保证双抗的稳定性和平衡两个抗体的表达量等。随着技术的进步，相信未来可以利用更多更好的策略来优化各种双特异性抗体，使其具有更强大的疗效和更低的副作用，为肿瘤患者带去福音。 /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 7、参考文献 /strong /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 曾静，双特异性抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 袁庆云，双特异性抗体药物在抗肿瘤治疗中的应用 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 闫莉萍，双特异性抗体药物非临床研究的考虑要点 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 郭婷婷，双特异性抗体药物的研究进展 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 吴丹青，双特异性抗体技术及其临床应用进展 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 黎晓维，双特异性抗体的结构设计及其装配工艺研究进展 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " 房世娣，双特异性抗体的结构及应用研究进展 /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " Recent advances of bispecific antibodies in solid tumors /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " Bispecific antibody based therapeutics：Strengths and challenges /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " Bispecific antibodies：design, therapy, perspectives /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " Bispecific antibodies for cancer therapy：A review /span /p p span style=" color: rgb(84, 141, 212) " Bispecific antibodies and their applications /span /p

双特异性T细胞衔接器（bispecific T-cell engager，BiTE）是一种能够同时结合肿瘤相关抗原（tumor associate antigen， TAA）和 CD3 复合物的抗体类抗肿瘤药物。传统的技术是通过靶向TAA 来实现肿瘤内T细胞上CD3信号通路的再激活，从而达到杀伤肿瘤细胞的效果【1-3】。自上世纪90年代起，针对双特异性抗体疗法的设计和改进已经有了近30年的研究。然而，目前为止只有安进公司（Amgen）的Blinatumomab (针对CD19 的 BiTE) 被FDA 批准用于治疗复发或难治性急性淋巴细胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia, ALL)【4,5】。以细胞因子风暴（cytokine storm）为主的副作用限制了其他针对实体瘤的BiTE所进行的临床测试。仅在2021年，安进公司就暂停了4种 BiTE的一期临床试验, 所涉及的抗原包括FLT3, BCMA, CD33和EGFRVIII。除了严重的副作用之外，半衰期短，TAA特异性低以及抑制性肿瘤微环境都是限制BiTE在体内发挥抗肿瘤效应的重要因素。因此，提升双特异性抗体的有效性并降低其副作用能够极大的促进该疗法在临床的广泛应用。图1 正在以单药形式进行临床测试的双特异性抗体2021年11月1日，美国德克萨斯大学西南医学中心傅阳心团队在Nature Biomedical Engineering杂志上发表了题为Rejuvenation of tumour-specific T cells through bispecific antibodies targeting PD-L1 on dendritic cells的文章。该研究构建了靶向免疫检验点PD-L1 和CD3ε的双特异性抗体 （PD-L1xCD3）。在多种小鼠肿瘤模型上，PD-L1xCD3比传统的TAA靶向性双特异性抗体（ErbxCD3）展现出了更强的抗肿瘤效果。利用多种条件性敲除小鼠表明，PD-L1xCD3在体内主要结合树突状细胞（dendriticcells， DCs）表达的PD-L1而并非肿瘤细胞或巨噬细胞表达的PD-L1，进而重新激活了肿瘤内部的抗原特异性CD8 T 细胞免疫反应来达到治疗肿瘤的效果。进一步的机制研究表明，PD-L1xCD3与DC上PD-L1的结合，促进了共刺激分子B7和CD28之间的相互作用，从而避免T细胞发生激活诱导的细胞死亡（activation-induced cell death），进而实现肿瘤内T 细胞长效激活的效果。研究团队首先在体外验证了制备的PD-L1xCD3能够同时结合PD-L1和CD3ε，并能够以PD-L1依赖的方式刺激T细胞活化并分泌IFNγ，杀伤肿瘤细胞。体内实验进一步表明PD-L1xCD3能够在MC38模型上产生良好的抗肿瘤效果并优于anti-PD-L1和anti-CD3的联合治疗，从而表明PD-L1xCD3具有其独特的作用机制。通过细胞过继转移和删除实验表明，PD-L1xCD3能够诱导抗原特异性CD8 T细胞反应并产生免疫记忆，而这一现象依赖于肿瘤内预存的CD8 T 细胞。为了研究PD-L1xCD3是否比传统的TAAxCD3具有更强的抗肿瘤效果，作者们制备了靶向TAA的ErbxCD3双特异性抗体，并通过体外实验证明其具有与PDL1xCD3相似的亲和力，激活T细胞能力和肿瘤细胞杀伤能力。然而体内实验却表明，在相同剂量下PD-L1xCD3比ErbxCD3展现出了更强的抗肿瘤效果，并且这一现象在TC1，B16F10，TuBo等多种模型上均得到了验证，提示靶向免疫检验点PD-L1的双特异性抗体比靶向TAA具有更好的激活T细胞能力。为了进一步探究产生这种区别的本质原因，作者们首先通过在不同的细胞上敲除了PD-L1来探寻哪种细胞表达的PD-L1对于PD-L1xCD3在体内的抗肿瘤效果是必须的。出乎意料的是，尽管肿瘤细胞本身是最主要的PD-L1阳性的细胞，但敲除肿瘤细胞上的PD-L1并没有影响PD-L1xCD3的治疗效果。与之相反，敲除宿主细胞上的PD-L1却彻底废除了PD-L1xCD3的治疗效果。通过条件性PD-L1敲除小鼠实验表明，树突状细胞而并非巨噬细胞表达的PD-L1起到了至关重要的作用。作者进一步利用Batf3敲除小鼠确认树突状细胞亚群（cDC1）对于PD-L1xCD3的治疗效果是不可或缺的。前期研究表明，anti-PD-(L)1 治疗能够通过增强B7-1(CD80) 与CD28的相互作用来达到激活T 细胞的效果6, 7。由此，研究人员提出了PD-L1xCD3治疗是通过增强共刺激信号来发挥作用的假设。结果也表明，用抗体阻断CD80/86后，PD-L1xCD3的治疗效果消失同时抗原特异性T细胞反应也大大减弱。通过体外共培养实验证明，PD-L1xCD3能够通过增强共刺激信号的方式促进IL-2的分泌，避免T细胞因过度激活导致的凋亡，从而实现肿瘤内T细胞的长效激活。传统BiTE的设计理念是通过单链抗体（ScFv）衔接T细胞与肿瘤细胞，促使T细胞活化并直接进行肿瘤细胞杀伤。然而，在肿瘤微环境里T细胞的数量和质量都非常有限。而肿瘤细胞不仅数量“占优”并且能够通过激活抑制性信号通路（如PD-L1/PD-1）来逃逸杀伤。与此同时，由于肿瘤细胞本身并不表达共刺激分子，其激活T细胞的效果非常有限。面对数倍于己的“敌军”，T细胞在反复杀伤的过程中很容易产生耗竭而败下阵来。与之相反，作为新型双特异性抗体，PD-L1xCD3能够将T细胞与树突状细胞衔接在一起，从而为其激活提供充足的条件（共刺激分子）。通过与树突状细胞的相互作用，T细胞不仅得到了有效的激活并且能够通过IL-2实现自我扩增。最终实现T细胞的持续性激活并获得持久的抗肿瘤免疫反应。图二：PD-L1xCD3的作用机理综上所述，该研究为新一代双特异性抗体设计提供了思路。证明了PD-L1xCD3 具有优于传统BiTE的如下特点：1）靶向肿瘤组织降低毒性；2）阻断PD-L1/PD-1相互作用，解除T细胞抑制；3）靶向DC细胞为T细胞激活提供共刺激信号，从而促进IL-2介导的T细胞存活。据悉，该论文已被选为Nature Biomedical Engineering 杂志11月份的封面故事。该研究的通讯作者是美国德克萨斯大学西南医学中心的乔健博士和傅阳心教授。刘龙超博士为论文的第一作者。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41551-021-00800-2

近年来，抗体药物的接连上市和重磅销售引发国内外抗体类生物治疗药物的研发热潮。抗体药物已经成为治疗肿瘤的明星产品。抗体类生物治疗药物的活性测定在质量控制中至关重要。活性测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。相关的生物技术在药物研发质控中的应用对新型抗体药物的发展带来一系列突破。为帮助从事相关研究的用户梳理生物制药质量控制研究技术及方法，仪器信息网特别策划了“抗体药研发的生物活性鉴定及功能分析”相关专题（点击查看）并邀请赛默飞蛋白和细胞分析技术应用高级经理冯彦斌先生分享对于抗体药的看法。他在文中主要分析了国内抗体药物的市场潜力、研发进展以及抗体药研发相关生物活性鉴定和功能分析的先进技术。赛默飞蛋白和细胞分析技术应用高级经理 冯彦斌仪器信息网：您如何看待近年来的抗体药市场发展变化与前景？ 冯彦斌：众所周知，近年来中国抗体药物市场规模增长异常迅猛，尽管目前中国总的抗体药物上市批准数量低于欧美，但增速方面已经接近欧美市场的两倍，蕴藏着巨大的潜力和空间。据统计，2018年我国抗体药物产业总体市场规模约183亿美元，预计2020-2025年平均年增长率为~15%，到2025年，我国抗体药的市场规模将超508亿美元。其主要的驱动因素有：1）肿瘤的发病和死亡率上升； 2）我国创新药优化的审评审批流程；3） 带量采购等政策驱动创新需求； 4）抗体药物逐渐被纳入医保目录。自2020年以来，国家药品监督管理局（NMPA）累计受理了超过200款国产抗体新药的临床试验申请。目前抗体药物研究最热门的靶点包括PD-1/PD-L1、TNF-α、VEGF、HER-2、CD20、EGFR 等。抗体药物最重要的应用领域为自身免疫类疾病和癌症（约65%的市场占比）。随着疾病机制的深入研究，抗体药物在哮喘、抗感染、血液病和心血管病领域的药物不断增加，并迅速拓展到其它相关领域。作为未来生物药的主力军，抗体药物创新研发则显得尤为重要。随着单抗生物类似药进入收获期，双特异性抗体、抗体偶联药物（ADC）、纳米抗体等药物市场也异军突起。创新型抗体加快了开发步伐，多种类型的抗体药物有望得到广泛的临床应用。从抗体创新药品种数量和国内产品临床申报数量上看，排名靠前的为恒瑞医药、复星医药、海正药业，而信达生物和康宁杰瑞产品数量超过了10个。创新类抗体药物基于其高特异性、低毒性、低转化周期等特征，将被更广泛地应用于各类疾病的治疗。未来几年，生物药仍是医疗领域的蓝海，也是人类健康的福音，未来发展前景良好。仪器信息网：近年来抗体制药的发展迅速，对于创新研发技术有何促进？ 冯彦斌：越来越多的研究表明，抗体药物由于靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，近年来已成为生物药行业中发展最快的分支。截至今日，美国FDA陆续批准了多个个治疗性抗体药物，其中传统单克隆抗体和人源化单抗已成主流，双特异性抗体开始初具规模。但在抗体功能优化、新抗体研发，特别是抗体规模化生产，以及抗体药物如何创新等问题仍是我们面临的巨大挑战。随着分子生物学、结构生物学、生物信息学等技术的发展，人们对抗体结构中各功能区的认识进一步加深，现在已经能够通过修改各功能区的序列、结构来赋予抗体新的特性和功能，这是抗体药物创新的基础。近年来抗体偶联药物（ADC）的发展主要依赖于以下研究领域的进展：①靶抗原及其特异性抗体的临床有效性及安全性得到验证，如靶向Her2 抗原的Herceptin 等；②高效的细胞毒性药物，如：美登素（maytansinoid，DM）、单甲基奥利他汀E（auristatin，MMAE）等；③新的连接臂和交联方法的发展，连接臂是决定抗体偶联药物ADC 药物活性的主要因素之一，它们应该在血液循环中相对稳定，到达靶细胞时通过内化进入细胞内，在溶酶体的低pH 条件下或蛋白酶作用下释放小分子药物。交联方法也从利用赖氨酸的随机连接向利用半胱氨酸的定点交联发展。新型药物拓宽了药物的治疗窗，因此备受关注，成为当前抗体药物发展的热点。持续上升的关注热点和研发投入的加大，使得创新技术也不断涌现。双特异性抗体药物由于其更好的特异性和低毒性，也越来越多地被投入研发管线；新靶点的筛选也一直是抗体药发现的努力方向，但其有效性和安全性需要获得更多的临床数据来验证，同时也有学者提出反向筛选靶向抗原的策略，以期通过反向药理学发现更多的候选靶分子。随着研究的持续深入，更多企业也加强了抗体工程下游技术的优化与整合。如在优化细胞培养条件、改造细胞系、抗体药物的质量控制、细胞培养工艺流程的改进等方面进行了诸多改良和优化。另外，未来基因工程抗体的发展方向将主要集中在通过合理改造抗体序列结构来提高基因工程抗体的药学特性，例如增加抗体药物的稳定性和均一性；通过双特异、多特异抗体以及抗体偶联物技术，赋予基因工程抗体药物新的药效功能；通过Fc 片段改造和糖基化改造，调节原有的效应功能和生物分布特性；通过创造新形式的抗体样分子骨架来发展具有更适宜的生物分布与代谢特性、抗原结合特性、药动学特性的新的“抗体”药物。 仪器信息网：请谈一下相应生物活性鉴定和功能分析的重要性和重要环节是什么？又发挥着怎样的作用？冯彦斌：随着生物制药领域的一大热点，治疗性抗体在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、炎症、感染性疾病及其他疾病中取得了重大进展，作为抗体药研发的重点和难点，除了抗体的获取即表达和纯化之外，建立高效、稳定、可信的抗体质量控制分析方法，以及其标准化和先进性是衡量抗体药物相关企业研发能力的重要标准之一。特别是目前研究较为热门的肿瘤特异性抗体功能分析，之前也有提及双特异性抗体甚至多特异性抗体，其最突出的优势就是靶向性强、特异性高和毒副作用低等，所以在其特异性功能分析方向我们也提供足以应对的核心武器。因此，需要关注治疗性抗体的功能研究，通过对特异性抗原结合、抗体介导的细胞毒性作用（ADCC）、补体介导的细胞毒性作用（CDC）、抗体介导的细胞吞噬作用（ADCP）等实验方法进行分析。如在杂交瘤体系构建过程中对于杂交瘤细胞培养、融合、筛选，就可以使用我们的EVOS智能活细胞成像系统对其进行包括增殖及细胞状态的长期成像监测。EVOS M7000 3D数字共聚焦活细胞成像分析系统（点击查看详细参数）对于药理药效、药代及药物安全性评价方面，高内涵筛选分析平台和Varioskan LUX多功能酶标仪，凭借其高效的全自动高通量多靶标筛选功能，以及其后续通过强大多参数数据分析软件多抗体药功能验证进行多维度评价和分析。CellInsight CX7 LZR 激光共聚焦高内涵筛选分析系统（点击查看详细参数）Varioskan LUX多功能酶标仪（点击查看详细参数）Attune NxT流式细胞仪则发挥着更为广泛的作用，通过结合特异性流式抗体对不同种类和亚群的免疫细胞进行鉴定和分析，从而评估机体的免疫功能状态；也可以对细胞的状态和功能进行监测，以实时评估细胞的功能状态和对肿瘤细胞的杀伤作用。Attune NxT流式细胞仪（点击查看详细参数）