蛋白偶联受体

大家好，本周为大家分享一篇来自Angewandte Chemie - International Edition的文章：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors[1]，文章的通讯作者是牛津大学化学系的Carol V. Robinson教授。　　非变性质谱(Native MS)是结构生物学中一个成熟的工具。在电喷雾电离过程中使用非变性缓冲液可以保存多组分蛋白质复合物之间的非共价相互作用，以及它们的配体、辅因子或其他结合蛋白。它可以用于探究蛋白质复合物的相互作用和功能，因为结合事件导致质量变化，可以在质谱仪中跟踪和剖析。然而，由于膜蛋白的疏水性，使得它们在传统的非变性质谱缓冲液中不溶且容易聚集，因此在非变性质谱中呈现出独特的挑战。目前采用的方法是将蛋白质复合物溶解到膜类似物中，例如：去垢剂、纳米脂质盘、两性聚合物等，再将这些膜类似物通过碰撞激活去除。其中去垢剂是应用的最广泛的一种。然而由于碰撞激活的能量在应用中受到限制，该方法并不能在质量分析前很好地去除去垢剂。此外，在非变性质谱条件下，键的断裂也受到非共价相互作用强度的影响(例如蛋白质-蛋白质、蛋白质-去垢剂剂以及去垢剂胶束内的相互作用)。　　基于光子的方法，如紫外光解离(UVPD)和红外多光子解离(IRMPD)已被证明有利于可溶性蛋白质及其复合物的Top-Down质谱分析。与此同时，基于光子的膜蛋白Top-Down模式的应用正在兴起。原理上，激光束路径中的离子被连续地驱动到振动激发态。因此，在基于光子的方法中，能量储蓄通常与前体离子的电荷状态和分子量无关。然而，电荷状态和分子量仍然会影响肽键解离需要的输入能量。先前报道的通过UVPD对79 kDa的五聚体的大电导机械敏感通道(MscL)Top-Down的断裂得到了令人印象深刻的54%的序列覆盖。然而，对于氨通道(AmtB)一个127 kDa的同源三聚体，通过碰撞激活和UVPD两种不同的方式破碎，仅实现了20%的序列覆盖率。事实上，相对较低的序列覆盖率是由于大分子量以及三聚体中增加的非共价相互作用影响的结果。尽管这些工具能够在非变性状态下实现Top-Down质谱分析，但其在膜蛋白表征中的应用仍不广泛。这就要求建立一种能使低电荷密度的高分子量蛋白质稳定地产生蛋白质序列离子的方法，而膜蛋白嵌入异质膜或膜类似物则使这一问题更加复杂。虽然IRMPD之前被用于从去垢剂中释放膜蛋白，但使用IRMPD对非变性的膜蛋白进行测序的研究相对较少。　　图1. (A)改进的Orbitrap Eclipse Tribrid的原理图，其中包括一个红外激光器直接进入四极线性离子阱(QLIT)的高压细胞。离子化的蛋白质胶束被转移到高压QLIT中，在那里整个离子群受到红外光子的照射，然后被转移到Orbitrap进行质量分析。通过调节激光输出功率(W)和照射时间(ms)，可以使膜蛋白从去垢剂胶束中完全解放出来。(B)三聚氨通道(AmtB)在3.0 W输出功率和200ms辐照时间下的非变性质谱。(C)在3.3 W输出功率和200ms辐照时间下AmtB的非变性质谱。　　因此，作者利用改进的Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪，与连续波远红外(IR) CO2激光器连接，使光束聚焦到双四极杆线性离子阱(QLIT)的高压池中(图1A)。红外激活可以有效地去除蛋白质复合物中的去垢剂胶束，随后通过IRMPD使得膜蛋白碎片化。在这种安排下，由纳米电喷雾电离产生的蛋白质复合物被转移到高压池中。在转移到Orbitrap进行检测或m/z分离和随后的碎片化之前，整个离子群将受到943cm-1红外光子的照射。利用红外的方法去除去垢剂胶束，红外激光有两个可调控参数:激光输出功率(高达60瓦)和照射时间(毫秒到秒)。因此，可以更好地控制从蛋白质胶束中释放膜蛋白，确保非变性复合物的保存，同时完全去除包裹复合物中的去垢剂。通过对激光输出功率和照射时间的优化，作者发现红外激活的参数是高度可调的，不同的激光功率和照射时间的组合也可以产生分辨率相当的谱图。其中例如在3.3 W下照射200 ms时，可以得到多个电荷态的三聚体峰(~6500 m/z)，也可以观察到三聚体与脂质结合的峰，而且对于图谱中的单体也能观察到与脂质结合的峰(图1C)。作者还对不同的去垢剂产生分辨率较高的图谱所需要红外参数进行了评估，从而评价了这几种去垢剂得到高分辨率图谱的难易程度(图2)。　　图2. 红外辐射去除膜蛋白离子中的去垢剂是高度可调的。增加激光输出功率对三种常用的MS兼容去垢剂(C8E4,G1和DDM) AmtB三聚体峰外观的影响。辐照时间固定为200 ms，激光输出功率分别为2.1、2.4、3.0和3.6 W。去垢剂在真空中按易去除的顺序显示，这是由完全释放膜蛋白复合物所需的激光输出功率决定的，从而在m/z光谱中产生良好分辨的电荷状态峰。为了探究IRMPD分离蛋白质和去垢剂胶束的机制，作者对三种不同的去垢剂：四聚乙二醇单辛醚(C8E4)、树突状低聚甘油(G1)和十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)的溶液相和气相红外光谱进行了表征，并利用密度泛函理论(DFT)计算得到了C8E4头部基团的红外谐波光谱，用来验证所得到的红外吸收光谱会受到振动耦合的影响，对于质子化的去垢剂离子，氢键和富氧去垢剂内的质子共享可以改变观察到的振动频率。结果表明C8E4胶束的溶液相吸收光谱包含一个与预期激光波数943cm-1重叠的显著带，这就解释了为何较低的激光能量可以将去垢剂胶束和蛋白质复合物分离。而在谐波光谱中在预期的激光波数处的确产生了峰，并推测该峰来自于O-H伸缩、C-C伸缩，C-H弯曲和C-O伸缩振动的耦合。而G1和DDM的最大吸收则偏离了943cm-1的预期波数，作者认为这是不同去垢剂氢键作用的结果。而蛋白质在真空中的红外吸收能力较弱，由此推测在IRMPD的过程中，去垢剂是主要的吸收对象。所以仅需要较低的能量就可以使蛋白质从复合物中剥离而不至于破坏蛋白质的非共价作用。完整的蛋白质离子还支持串联质谱的实验，为了得到蛋白质的序列信息，作者分离了m/z在6674处(电荷态为+19)的AmtB三聚体蛋白，并将其置于高激光输出功率(9 W)下照射5 ms，在m/z 1750~4000之间产生密集的多电荷态离子片段，并得到了26%的序列覆盖，这优于之前基于碰撞激活的方法(　　图3. 三聚体AmtB的IRMPD。(A)在m/z 6674处分离19+电荷态离子阱后，IRMPD后观察到的碎片离子MS2谱。多重带电碎片被高亮显示 来自相同地点的重复片段用虚线分组。为了清楚起见，许多指定的离子没有注释 (B)片段丰度相对于裂解原点(残基数)的条形图，其中丰度表示来自每个位点的片段归化一强度之和。条形图的颜色强度表示每个片段的加权平均电荷。将AmtB的拓扑域叠加在条形图上 α-螺旋跨膜区域用黄色方框表示，编号为1到11。跨膜区由质周环和细胞质环连接，用灰色线表示。(C)主干裂解位点覆盖在AmtB (PDB: 1U7G)的结构上。蓝色和红色阴影区域分别代表b型和y型离子。颜色强度对应于所分配片段的丰度。从气相分子动力学模拟中得到的高温(500 K)下的跨膜螺旋快照用虚线圈标出。为了验证这一个推测，作者又对另外两种GPCR蛋白：β -1-肾上腺素能受体(β1AR)和腺苷A2A受体(A2AR)用IRMPD进行了MS2图谱的测定，结果也观察到了片段离子相似的二级结构定位，在跨膜结构区域有着高丰度的片段，但是在二硫键相连的螺旋中并没有观察到丰富的离子片段。并再次利用分子动力学模拟研究了两种GPCR的结构对断裂的影响。在500 K下的最终结构中显示，两种GPCR中都保留了α-螺旋特征，并与观察到的裂解位点密切相关。此外，还对这两种蛋白进行了HCD和IRMPD的比较分析。对于β1AR, IRMPD产生的片段离子平均分子量为8866 Da，高于HCD产生的5843 Da。IRMPD产生的片段离子也保留了更高的平均电荷(4.7 + vs 3.6+ z)。最终，IRMPD的碎片化导致β1AR的序列覆盖率更高，为28%，而HCD为17%。在A2AR中也观察到类似的趋势，IRMPD的覆盖率为19%，而HCD为9%。　　总的来说，作者证明了可以在改进的Orbitrap Eclipse质谱仪的高压QLIT下，通过红外照射可以完全释放一系列去垢剂胶束中的膜蛋白。然后，通过增加激光输出功率，获得直接从膜蛋白及其复合物中释放的序列信息片段离子，证明红外光去除去垢剂是通用的和高度可控的，为保存和鉴定膜蛋白和配体之间脆弱的非共价相互作用构建了一个可靠的方法。而且还对片段离子的产生机制做了阐述，即质子可以通过沿蛋白质骨架迁移来稳定和诱导连续的肽键裂解。　　撰稿：李孟效　　编辑：李惠琳　　文章引用：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors　　参考文献　　Lutomski, C.A., El-Baba, T.J., Hinkle, J.D., et al. Infrared multiphoton dissociation enables top-down characterization of membrane protein complexes and g protein-coupled receptors[J]. Angewandte Chemie-International Edition，2023.

英国Randox-lifescience公司生产药物残留检测单克隆和多克隆抗体，ELISA试剂盒，以及偶联BSA/BTG蛋白抗原，主要产品有： 抗生素（磺胺喹恶啉、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、氯霉素、喹诺酮类药物），呋喃唑酮代谢物（AOZ、AMOZ、SEM、AHD），&beta -兴奋剂类（克伦特罗、莱克多巴胺），雌激素（玉米赤霉烯醇、沙丁胺醇）等。

大家好，本周为大家分享一篇文章，Added Value of Internal Fragments for Top-Down Mass Spectrometry of Intact Monoclonal Antibodies and Antibody−Drug Conjugates [1]，文章的通讯作者是加州大学洛杉矶分校化学与生物化学系的Joseph A. Loo教授。　　抗体-药物偶联物(Antibody - drug conjugates, ADC)是一种很有前景的治疗药物，它通过linker为抗体提供高效的细胞毒性有效载荷，以提高其抗肿瘤功效。将linker和有效载荷偶联到抗体上，给ADC带来了额外的异质性，增加了对其全面表征的挑战。自上而下的质谱(TD-MS)技术近年来在单克隆抗体的表征中得到了广泛的应用，与自下而上质谱(BU-MS)和中下质谱(MD-MS)相比，TD-MS具有最简单的样品制备流程和保留单克隆抗体内源性修饰的优势。然而，对于抗体大小的蛋白质和具有显著二硫键组成的蛋白质，TD-MS的断裂效率较低，获得的序列和药物偶联位点信息有限。　　为了增加TD-MS的序列信息含量，一种策略是将不包含蛋白质序列N端和C端的内部片段纳入数据分析工作流程中，这种方法已被证明有助于二硫化完整蛋白的TD-MS表征。在这篇文章中，作者发现在TD-MS中分配内部片段将mAb序列覆盖率提高到75%以上，并允许确定链内二硫键连接和各种N-糖基化类型。对于治疗性非特异性赖氨酸连接ADC，几乎60%的假定药物偶联位点被识别。　　内部片段可以在不破坏二硫键的情况下进入结构紧密、碎片化效率高度受限的区域，因此有可能大大增强完整单克隆抗体的序列信息。作者对完整的NIST单抗的5个最丰富的电荷态采用了ECD和HCD两种碎片化方法，并将每个电荷态的两种碎片化方法的TD-MS结果结合分析。内部片段的纳入提高了二硫键约束区域的序列覆盖，例如，轻链Cys133和Cys193之间的二硫约束序列几乎完全由内部片段覆盖(图2A)，重链的Cys147-Cys203和Cys264-Cys324序列区也是如此(图2B)，而这些区域是末端片段难以触及的。CDR的覆盖率从53%增加到60%，这表明纳入内部片段可以更深入地了解这一关键区域。总体来说，轻链的序列覆盖率从54%提高到83%，重链从28%提高到72%，合并后整个NIST单抗的序列覆盖率从36%增加到76%(图1)。重链比轻链的覆盖率提高更为显著，这表明随着蛋白质分子量增大，分配内部片段变得更有价值。　　图1. 考虑(A)轻链、(B)重链和(C)全单抗内部片段前后不同序列区域的序列覆盖率，包括非二硫约束序列(Free)、二硫约束序列(SS-constrained)、全序列(Full)和CDR序列(CDR)　　图2. (A)轻链和(B)重链的NIST mAb序列覆盖图谱。蛋白质骨架上的蓝色、红色和绿色切割分别代表b/y、c/z和by/cz片段。序列上方的实线表示末端片段序列覆盖率，序列下方的实线表示内部片段序列覆盖率。紫色虚线表示链内二硫键，浅灰色表示受二硫键约束的序列区域，橙色表示互补决定区域(cdr)。　　HCD能够在不破坏二硫键的同时仅碎裂蛋白质主干，因此作者在完整的NIST单抗上应用HCD来生成含有完整二硫键的片段，以确定二硫键连接。在每个形成链内二硫键的半胱氨酸上应用-1H的修饰，以表明它们的完整性。对于轻链，52个末端片段和12个内部片段穿过S - S键I, 17个末端片段穿过S - S键II, 6个末端片段穿过两个二硫键，清楚地显示了这两个二硫键的连接模式(图3A)。靠近重链两端的两个二硫键，S - S键I和S - S键IV，被89个末端片段和9个内部片段穿过 而中间的两个二硫键，S−S键II和S−S键III，只有24个内部片段穿过，没有末端片段穿过(图3B,C)。这些结果证明了NIST单抗重链的链内S - S连通性，重要的是，中间的两个S - S键模式只能由内部片段确定。除了确定链内S - S连通性外，分配内部片段也有助于鉴定N糖基化。当纳入内部片段时，额外分配了25个含有G0F的片段，42个含有G1F的片段和34个含有G2F的片段，这表明分析内部片段对N-糖基化鉴定的能力。　　图3. (A)轻链、(B)重链、(C)仅含完整NIST单抗内部片段的重链，在每个形成链内二硫键的半胱氨酸上施加一个氢损失后，通过HCD TD-MS生成片段位置图。　　内部片段可以确定赖氨酸连接ADC的药物偶联位点。作者采用了类似的方法，将ECD和HCD应用于先前已充分表征的非特异性赖氨酸连接ADC。ADC的TDMS在轻链上仅产生8个与DM1结合的末端片段(图4A)。分配内部片段显著提高了DM1偶联位点的测定。ADC的TD-MS在轻链上产生61个1- dm1结合和15个2 - dm1结合的内部片段，定位了3个偶联位点(K106, K114, K133)，并将鉴定的两个偶联位点缩小到4个赖氨酸残基(K153, K160, K170, K175)(图4A)。对于重链也观察到类似的结果。综上所述，对于完整的ADC，仅用末端片段确认了16个偶联位点，而在包含内部片段后，这一数字增加到52个，覆盖了约58%的抗体所有假定的偶联位点。　　图4. 由ECD和HCD TDMS生成的完整IgG1-DM1 ADC (A)轻链和(B)重链片段位置图。黑色垂直虚线表示赖氨酸的位置。　　在这项工作中，作者首次报道了在完整的NIST单抗和异质赖氨酸连接ADC的TD-MS表征中分析内部片段的好处。内部片段的包含末端片段难以达到的二硫键约束区域，显著增加了完整单克隆抗体的序列覆盖率。重要的PTM信息，包括二硫键模式和N糖基化，可以通过包含内部片段获得。最重要的是，内部片段可以帮助确定高度异质赖氨酸连接ADC的药物偶联位点。　　撰稿：夏淑君　　编辑：李惠琳　　文章引用：Added Value of Internal Fragments for Top-Down Mass Spectrometry of Intact Monoclonal Antibodies and Antibody-Drug Conjugates