微聚焦荧光仪

一台简单的倒置荧光显微镜，搭配CSIM 100单点扫描模块，就可以快速升级为共聚焦成像系统，实现高分辨率共聚焦成像。 对，是共聚焦，您没有看错！让您实验室的显微镜大-变-身！轻松获取高端大气上档次的照片！快来看看是如何实现的吧！ CSIM 100是一款单点扫描模式的共聚焦产品，可通过C接口与任意品牌的荧光显微镜连接，将原有的宽场荧光成像方式升级为共聚焦成像方式，全面提升成像质量。Coherent OBIS激光器使用相干公司OBIS LX系列激光器，相比于普通的半导体激光器，在波长稳定性、功率稳定性、光束质量上有明显优势。可提供高质量、高品质的光源。优点：最多可同时配置4个激光器固体或半导体激光器长寿命，可达10000小时稳定性好，8小时功率变化＜2%即开即用，操作方便Hamamatsu滨松PMT使用目前的新一代高性能产品：R10699多碱PMT，相比国外品牌的上一代共聚焦产品使用的R928，灵敏度提高超过一倍。可升级为磷砷hua镓（GaAsP），进一步提高了图像的信噪比： GaAsP 的量子效率达到45%。优点：高性能多碱PMT*光谱响应范围185nm~900nmQE 25%@500nm20%@600nm* 可升级为GaAsPSunny XY高速扫描振镜搭载Sunny XY高速扫描振镜后，单向扫描512*512成像速度可达4fps，适用于多细胞大视野的检测应用。*已经为zeiss OCT项目供货。优点：响应时间快重复精度高发热量低温度漂移小其它配件共聚焦/宽场切换接口接口可同时连接共聚焦和相机，可自由选择共聚焦成像或相机成像电动Z轴马达使手动显微镜实现自动调焦功能，实现XYZ三维扫描软件功能全中文界面，简单易用全软件控制完成多维图像采集，实现多通道扫描、时间序列和Z轴序列成像可在用户自定义的ROI(感兴趣区域）内进行成像、光漂白和光刺激全软件控制数据记录，支持成像参数管理导出支持多种图像输出格式

毛细管聚焦的微束X射线荧光谱仪及其应用研究邵金发，侯禹存，程琳*（北京师范大学核科学与技术学院，射线束技术教育部重点实验室 100875）摘要随着科技的发展，人们对物质的分析慢慢深入到微区领域。而微束能量色散X射线荧光作为一种高灵敏、高精度的元素分析技术，已然成为物质微区分析的有利工具。本实验室将毛细管X射线聚焦技术与能量色散X射线荧光分析技术相结合，自行设计研发了一种新型毛细管聚焦的微束X射线荧光谱仪。该谱仪在利用毛细管X光透镜的特点将X射线源发出的X射线束会聚到微米量级的同时，基于激光位移传感器开发了自动调整样品测量点到透镜出口端距离的闭环控制系统，有效的减少由于样品表面不平整或弧度带来的测量误差，弥补了现有微束Ｘ射线荧光谱仪在此方面的不足。因此，该微束Ｘ射线荧光谱仪为表面不平整文物样品的无损微区元素分析提供了解决方案。1. 引言微束能量色散X射线荧光光谱（Micro-energy dispersive X-ray fluorescence， µ-EDXRF）分析技术因其快速、准确、无损分析等优点，被广泛应用在考古、地质、环境、材料、生物等科学领域[1-8]。目前，基于实验室光源以获得微束入射X射线的方法主要有准直器限束和X射线光学器件聚焦两种。通过准直器限束获得微束入射X射线是最早在微束X射线荧光谱仪中使用的方法，具体为采用准直狭缝或小孔作为光阑放置在入射光路上，用以减小入射X射线的发散度。但与此同时，入射光束的强度会因为物理阻挡而降低，从而导致获得的特征X射线信息减弱。而多毛细管X光透镜利用X射线全反射原理，可将在空心毛细管内表面上的多次全反射的X射线会聚于焦点。因此可以实现以较大的角度收集从X射线源产生的X射线，且会聚后X射线的束斑大小可低至几十微米。同时，毛细管X光透镜对Cu-Kα的能量有高达2-3个数量级的放大倍数[9]，且具有低的发散度。同时，可以将基于毛细管聚焦的微束能量色散X射线荧光分析技术与大面积扫描相结合，实现微米级表面结构和元素分布的分析测定。目前国内外存在部分商业化的微束X射线荧光谱仪，其中美国EDAX公司生产的Orbis系列微束X射线荧光谱仪，适用于部分地质和考古样品测试的[10]；德国Bruker公司生产的M4 Tornado可移动式微束X射线荧光谱仪，适用于实验室或博物馆内各类样品的研究[11]。但由于部分文物样品表面并不平整或存在较大的弧度，若不对相对位置进行修正，这将使得样品测量点与毛细管Ｘ光透镜出口端的距离在测量过程中发生改变，从而影响测量结果的准确性和元素区域扫描的分辨率[12]。为解决上述问题，本实验室自行设计和开发一种新型的微束X射线荧光谱仪以及相应的计算机控制程序，并且开展了相关分析方法学的研究。2. 仪器组成本实验室设计的毛细管聚焦的微束X射线荧光谱仪结构示意图如图1所示，其主要由微焦斑X射线管（Mo靶，焦斑大小50μm×50μm，德国Röntgen公司）、毛细管X光透镜（Mo-Kα能量处束斑大小为31µm）、SDD X射线探测器（5.9keV时能量分辨率为145eV，铍窗有效面积25mm2）和PX5多道分析器、精度为20µm的激光位移传感器、激光笔、具有20倍放大功能的1400万像素固定焦距CCD摄像头、高精度XYZ三维样品台，以及在LabVIEW语言环境下开发的仪器控制程序等部分组成。仪器控制软件主要包括探测系统控制界面、X射线源高压控制界面、机械运动系统控制界面、CCD图像采集控制界面和氦气控制界面构成。其中主界面包含了各个控制功能系统的一些主要控制命令及输出，如图2所示。谱图显示区域在探测过程中实时显示X射线探测器探测到的谱图。此外，该仪器使用的高精度自动化三维运动平台可以满足微区的二维μ-EDXRFF分析的需求，以便实现对感兴趣区域内元素分布的分析。图1 微束X射线荧光谱仪的结构示意图图2 微束X射线荧光谱仪控制程序主界面3. 实验分析3.1 清代红绿彩瓷的分析为了评估本仪器对样品微区进行元素二维扫描分析的能力，选取一片清代红绿彩瓷的残片作为研究对象（图3）。选取图3中A（白釉）、B（红彩）、C（绿彩）进行微区的元素组成分析。实验测量时，X射线管电压40 kV，电流0.6 mA，探测活时间300 s。样品A（白釉）、B（红彩）、C（绿彩）三点的微束X射线荧光分析的能谱如图4所示，彩料中各元素化学成分采用基本参数法进行定量分析，所得的数据如表1所示。图3 清代红绿彩瓷残片与感兴趣区域图片图4 红绿彩中白釉、红彩和绿彩的μ-EDXRF光谱表1 白釉、红彩和绿彩的化学成分（质量分数，%）此外，选择如图3中2mm×2mm的感兴趣区域，使用微束X射线荧光谱仪进行µ-EDXRF二维扫描分析。进行µ-EDXRF二维扫描分析时，X射线管电压为40 kV，电流为0.6 mA，扫描步距为30 µm，每个点探测时间为1.5 s，扫描数据经软件处理得到如图5所示的元素分布图。图5 扫描区域内Pb、K、Fe、Ca、Cu、Al、Mn、Si元素的分布3.2 吉州窑古陶瓷的分析为评估本仪器对表面存在大弧度的样品进行微区元素二维扫描分析的能力，选取一片吉州窑古陶瓷的残片作为研究对象（图6）。实验开始前调节平移台使样品表面感兴趣区域清晰呈现在CCD图像中，并通过鼠标在控制界面的CCD视野中选择具体的目标扫描区域。选取图6中大小为10mm×10mm的区域进行元素二维扫描分析。µ-EDXRF二维扫描分析的测量条件与上文相同。同时，为验证本仪器“源-样”距离自动控制系统对测量结果的影响，分别在开启和关闭“源-样”距离自动控制系统的条件下进行元素二维扫描分析，扫描数据经软件处理得到如图7所示的元素分布图。图6 吉州窑古陶瓷样品与扫描区域图片图7 扫描区域内K、Ca、Zn、Fe元素分布图。a）关闭“源-样”距离自动控制系统，b）开启“源-样”距离自动控制系统通过图7与图6的比较可知，在关闭“源-样”距离自动控制系统的情况下进行µ-EDXRF二维扫描时，由于样品表面的弯曲，样品测量点与毛细管X光透镜出口端之间的距离发生变化，使得X射线光束的焦点无法与样品测量点重合。这导致测得元素分布图空间分辨率变差，同时生成的图像发生了扭曲。相反，当打开“源-样”距离自动控制系统进行测量时，由于该系统可实时调整平移台使X射线束准确照射在样品测量点上，显著降低由于样品表面弯曲带来的偏差。极大的改善了测量结果，表明该仪器在不平整样品的µ-EDXRF二维扫描中具有重要的应用价值。4. 结论本实验室将毛细管X射线聚焦技术与能量色散X射线荧光分析技术相结合，设计和研发了一种新型毛细管聚焦的微束X射线荧光谱仪。该微束X射线荧光谱仪在具备无损分析微小样品和样品微区的元素分布能力的同时，其基于激光位移传感器开发的“源-样”距离自动控制系统可实时调整样品测量点到透镜出口端距离，显著降低了由样品表面不平整或弧度带来的测量偏差，弥补了现有微束Ｘ射线荧光谱仪在此方面的不足。因此，其在材料科学、地球科学和文物保护等领域有着广泛的应用前景。参考文献[1] 戴珏,吴奕阳,张元璋,等.能量色散X射线荧光光谱法在检测仿真饰品中有害元素的应用[J].上海计量测试,2018,45(04):34-35.[2] 陈吉文,倪子月,程大伟,等.基于EDXRF的土壤中痕量镉的快速检测方法研究[J].光谱学与光谱分析,2018,38(08):2600-2605.[3] 陈曦,周明慧,伍燕湘,等.能量色散X射线荧光光谱仪在稻米中镉含量测定的应用研究[J].食品安全质量检测学报,2018,9(10):2331-2338.[4] 蒯丽君. 化学前处理—能量色散X射线荧光光谱法应用于矿石及水体现场分析[D].中国地质科学院,2013.[5] Rathod T, Tiwari M, Maity S , et al. Multi-element detection in sea water using preconcentration procedure and EDXRF technique [J]. Applied Radiation & Isotopes, 2018, 135.[6] Figueiredo E, M F, Araújo, Silva R J C, et al. Characterisation of Late Bronze Age large size shield nails by EDXRF, micro-EDXRF and X-ray digital radiography [J]. Applied Radiation & Isotopes Including Data Instrumentation & Methods for Use in Agriculture Industry & Medicine, 2011, 69(9):1205-1211.[7] Natarajan V, Porwal N K, Babu Y, et al. Direct determination of metallic impurities in graphite by EDXRF. [J]. Appl Radiat Isot, 2010, 68(6):1128-1131.[8] Li L, Huang Y, Sun H Y, et al. Study on the property of the production for Fengdongyan kiln in Early Ming dynasty by INAA and EDXRF [J]. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms, 2016, 381:52-57.[9] Bonfigli, Francesca, Hampai, et al. Characterization of X-ray polycapillary optics by LiF crystal radiation detectors through confocal fluorescence microscopy[J]. Optical Materials, 2016, 58: 398-405.[10] Moradllo M K, Sudbrink B, Hu Q, et al. Using micro X-ray fluorescence to image chloride profiles in concrete[J]. Cement & Concrete Research, 2016:S0008884615300636.[11] Ramos I. Pataco I M, Mourinho M P, et al. Elemental mapping of biofortified wheat grains using micro X-ray fluorescence[J]. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 2016.[12] Ricciardi P，Legrand S，Bertolotti G, et al. Macro X-ray fluorescence (MA-XRF) scanning of illuminated manuscript fragments: potentialities and challenges[J]. Microchemical Journal, 2016, 124:785-791.*通讯作者程琳，工学博士，美国加州大学尔湾分校访问学者。现任职于北京师范大学核科学与技术学院，教授，博导。长期从事毛细管聚焦的微束X射线分析技术的研究及相关设备的研发；目前已经成功研发出国内首台毛细管聚焦的微束X射线荧光谱仪和毛细管聚焦的X射线衍射仪等设备并开展相关的分析技术及应用研究；作为项目负责人已经承担多项国家自然科学基金、北京市自然科学基金和北京市科技计划项目等,国家自然科学基金评审专家、北京市高新技术企业评审专家和X-ray spectrometry等国际刊物审稿人。e-mail: chenglin@bnu.edu.cn

激光共聚焦荧光显微镜 活体荧光物质检查激光共聚焦显微镜，简称CLSM（Confocal Laser Scanning Microscopy），是一种利用激光共振效应进行成像的显微镜。它通过使用激光束扫描样品的不同层面，将所得到的图像合成成一幅清晰的三维图像。与传统显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率和更强的穿透能力，可以观察到更加细微的结构和更深层次的物质。在活体荧光物质的检查中，激光共聚焦显微镜发挥了重要的作用。通过标记活体细胞或组织的特定结构或分子，激光共聚焦显微镜可以实时观察到这些结构或分子的活动和分布情况。在生物医学领域，它可以用于观察细胞的生长、分裂和死亡过程，研究细胞信号传导和分子交互作用等。在药物研发中，它可以用于观察药物在活体细胞或组织中的分布情况，评估药物的疗效和毒性。此外，在神经科学领域，激光共聚焦显微镜可以用于观察神经元的活动和连接，揭示大脑的工作机制。NCF950激光共聚焦显微镜较宽场荧光显微镜的优点：&bull 能够通过荧光标本连续生产薄（0.5至1.5微米）的光学切片，厚度范围可达50微米或更大。（主要优点）&bull 控制景深的能力。&bull 能够从样品中分离和收集焦平面，从而消除荧光样品通常看到的焦外“雾霾”，非共焦荧光显微镜下无法检测到。（最重要的特点）&bull 从厚试样收集连续光学切片的能力。&bull 通过三维物体收集一系列图像，用于二维或三维重建。&bull 收集双重和三重标签，精确的共定位。&bull 用于对在不透明的图案化基底上生长的荧光标记细胞之间的相互作用进行成像。&bull 有能力补偿自发荧光。耐可视共聚焦成像效果图 尼康共聚焦成成像效果图NCF950激光共聚焦显微镜应用，共聚焦显微镜在以下研究领域中应用较为广泛：1、细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡；2、生物化学：酶、核酸、FISH、受体分析3、药理学：药物对细胞的作用及其动力学；4、生理学：膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态；5、遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断；6、神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递；7、微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构；8、病理学及病理学临床应用：活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断；9、生物学、免疫学、环境医学和营养学。NCF950激光共聚焦显微镜配置NCF950激光共聚焦配置表激光器激光405 nm、488 nm、561 nm、640 nm探测器波长：400-750nm，探测器：3个独立的荧光检测通道；1个DIC透射光检测通道扫描头最大像素大小：4096 x 4096 扫描速度：2 fps（512 x 512像素，双向），18 fps（512 x 32像素，双向），图像旋转: 360°扫描模式X-T, Y-T, X-Y, X-Y-Z, X-Y-Z-T针孔无级变速六边形电动针孔；调节范围：0-1.5毫米共焦视场φ18mm内接正方形图像位深12bits配套显微镜NIB950全电动倒置显微镜光学系统NIS60无限远光学系统（F200)目镜(视野)10×(25)，EP17.5mm，视度可调-5～+5，接口Φ30观察镜筒铰链式三目观察镜筒，45度倾斜，瞳距47-78mm，目镜接口Φ30，固定视度；1）目/摄切换：（100/0,50/50,0/100)；2）目视/关闭目视/可调焦勃氏镜NIS60物镜10×复消色差物镜，NA=0.45 WD=4.0 盖玻片=0.1720×复消色差物镜，NA=0.75 WD=1.1 盖玻片=0.1760×半复消色差物镜，NA=1.40 WD=0.14 盖玻片=0.17 油镜100×复消色差物镜，NA=1.45 WD=0.13 盖玻片=0.17 油镜物镜转换器电动六孔转换器（扩展插槽），M25×0.75聚光镜6孔位电动控制：NA0.55，WD26；相衬(10/20,40,60选配）DIC（10X，20X/40X）选配.空孔照明系统透射柯拉照明，10W LED照明；落射照明：宽场光纤照明6孔位电动荧光转盘（B，G，U标配）；电动荧光光闸；中间倍率切换手动1X，1.5X、共焦切换机身端口分光比：左侧:目视=100：0；右侧:目视=100：0；平台电动控制：行程范围130 mm x100 mm （台面325 mm x 144 mm ）最大速度：25mm/s；分辨率：0.1μm - 重复精度：3μm。机械可调样品夹板调焦系统同轴粗微动升降机构，行程：焦点上7下2；粗调2mm/圈，微调0.002mm/圈；可手动和电动控制，电动控制时，最小步进0.01um；DIC插板10X，20X，40X插板；可放置于转换器插槽；选配控制摇杆，控制盒，USB连接线软件软件：NOMIS Advanced C图像显示/图像处理/分析2D/3D/4D图像分析，经时变化分析，三维图像获得及正交显示，图像拼接，多通道彩色共聚焦图像