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1. 实验材料薯蓣皂苷元标准品母液的配置:精确称取薯蓣皂苷元标准品(纯度98%)5mg,溶于10ml甲醇中,母液浓度为0.5mg/ml(0.5μg/μL),现用现配;2. 实验方法标准曲线的建立:分别吸取0、4、8、12、16、20μL 薯蓣皂苷元标准母液于新的96微孔板的每个孔中,每个浓度3个重复,室温条件下挥干溶剂,然后每个孔内添加200μL 70-72%的高氯酸,然后迅速将微孔板放入经预热的微孔板分光光度计内,35℃,摇振2min,静止10min后,在350nm~700nm波长范围内扫描其最大吸收波长,并在最大吸收波长下测定吸光值,根据最大吸收波长及系列标准溶液中的diosgenin的含量,绘制标准曲线。 图1为薯蓣皂苷元在在350nm~700nm波长范围内的光谱扫描图,根据图1所示,可确定其最佳吸收波长为410nm。 图2为根据高氯酸显色分光光度法最终得到的标准曲线,线性回归方程为y=0.1218x+0.0404,r=0.9988。y代表410nm处的吸光值,x代表反应体系中的diosgenin含量(μg)。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/09/201509171254_566402_3033448_3.png图1 薯蓣皂苷元的光谱扫描图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/09/201509171255_566403_3033448_3.png图2 薯蓣皂苷元的标准曲线3.结果与讨论样品中薯蓣皂苷元含量的确定:将提取制备的薯蓣皂苷元粗提物用甲醇完全溶解,然后吸取体积的样品溶液至新的96-微孔板的孔内,室温下挥干溶剂,然后按照上述实验条件进行检测,最后根据其在410nm处的吸光值和线性回归方程y=0.1218x+0.0404计算,可得出薯蓣皂苷元的含量。
工作需要测总抗氧化值 想用 ORAC方法。有人用荧光微孔板分析仪但价格太贵,铂金爱尔默公司说是70万。想请教高手,这个实验能不能不用荧光微孔板分析仪,只用荧光分光度计能不能做成?激发波长是485,发射波长是535nm.[em0808]
分光光度计和酶标仪都是实验室常用的两种仪器,它们的测定原理是相同的,都是使用朗伯-比耳定律,测定的都是样本的吸光度。酶标仪按照功能的不同划分,可以分为(1)光吸收酶标仪(可见酶标仪,紫外/可见酶标仪)(2)荧光酶标仪(3)化学发光酶标仪。分光光度计按照波长及应用领域的不同可以分为:(1)可见光分光光度计(2)紫外分光光度计(3)红外分光光度计(4)荧光分光光度计(5)[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收[/color][/url]分光光度计。 分光光度计和酶标板存在一些不同之处,具体差别体现在以下三个方面: (1)盛装待测溶液的容器:分光光度计用的是比色皿,酶标仪使用的是塑料微孔板(酶标板)。比色皿只能起到盛装溶液的作用,每个比色皿一次只能盛装一种溶液。酶标板常用透明的聚乙烯材料制成,对抗原抗体有较强的吸附作用,因此用它作为固相载体,酶标板通常为48孔或96孔,每个微孔可以盛装不同的溶液。 (2)光路的方向:分光光度计是水平光路,而酶标仪则是垂直光路。由于酶标板盛样本的塑料微孔板是多排多孔的,光线只能垂直穿过,因此酶标仪的光束都是垂直通过待测溶液和微孔板的,光束既可是从上到下,也可以是从下到上穿过比色液。垂直光的特点是标本吸光度受液体浓缩或稀释的影响小,不足之处是受被测样本液面是否水平、酶标板透光性、孔底是否平整等的影响较大。 (3)光路的长度:由于光密度(OD值)与吸光系数, 待测组分的浓度以及光路长度成正比关系。分光光度计采用的比色杯的宽度通常是25px,所以光路长度固定为25px。因此不同仪器,不同批次测量的数据具有同样的可比性。而酶标仪采用的是垂直光路, 所以光路的长度应该是液体液面的高度,所以测得的值受到样品的体积的影响。