怎样从总rna中进行mrna的分离和纯化
目前常用的mRNA的纯化方法有:(1)寡聚(dT)-纤维素柱层析法,即分离mRNA的标准方法;(2)寡聚(dT)-纤维素液相离心法,即用寡聚(dT)-纤维素直接加入到总的 RNA溶液中并使mRNA与寡聚(dT)-纤维素结合,离心收集寡聚(dT)-纤维素/mRNA复合物,再用洗脱液分离mRNA,然后离心除去寡聚(dT)-纤维素;(3)其它一些方法:如寡聚(dT)-磁性球珠法等。本实验应用方法(1)进行mRNA的分离纯化。【试剂与器材】(一)试剂1. 0.1mol/L NaOH ,每组200mL2. 寡聚Oligo(dT)-纤维素3. 加样/洗涤缓冲液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。4. 洗涤缓冲液2:0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SDS至终浓度。5. 5 mol/L NaCl,每组10mL6. 3 mol/L NaAc pH5.2,每组10mL7. 无RNase双蒸水(DEPC水),每组100mL8. 70%乙醇,每组10mL注意:溶液5,6的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜,溶液1,3,4,8则用经0.1% DEPC处理过的无RNase双蒸水配制,Tris应选用无RNase的级别。溶液配制后,最hao能够按一次实验所需的分量分装成多瓶(如10ml或50ml/瓶)保存,每次实验只用一份,避免多次操作造成对溶液的污染。