小鼠大脑

优势● iMScope QT可测量的最大范围超过100万像素，能够进行大面积样本分析，例如在一次检测中对小鼠大脑全切片进行分析。● iMScope QT的分析速度比前一代产品快8倍以上，能够进行快速分析。● iMScope QT具有高质量准确度、分辨率及高空间分辨率，能够进行精确质谱成像分析。 概述质谱成像技术可以通过质谱仪直接检测生物分子和代谢物，同时保留其在样本组织上的位置信息，因此，可以生成不同生物分子基于特定离子信号强度和位置信息的二维质谱图像。iMScope成像质谱显微镜是用于质谱成像分析的整合型仪器，结合了光学显微镜和质谱仪，能够分析物质的结构和分布特征，拓展了药物研发和代谢物研究等领域的范围。通过将MALDI转换成LC和ESI系统，iMScope还可用于LC-MS定性及定量分析。本文将介绍配备Q-TOF质谱仪的新型iMScope QT（图1），并与前一代iMScope TRIO设备进行比较。图1 iMScope QT 小鼠全脑切片分析前一代iMScope TRIO设备的最大可测量范围是250 × 250像素。在iMScope QT中，可测量范围已扩展至1024 × 1024像素，能够以15 μm的空间分辨率分析小鼠全脑切片（约17mm × 9.4 mm）。根据表1条件进行检测，可在m/z 885.557处获得磷脂酰肌醇PI (38:4)，并在m/z 888.631处获得硫苷脂(C24:1)的清晰质谱图像（图2）。 此外，由于iMScope QT的最大激光频率为20 kHz，分析速度比iMScope TRIO快8倍以上。结果显示完成图2所示的小鼠全脑切片（702624 pix）质谱成像分析仅需6小时。 表1 分析条件图2 小鼠全脑切片的质谱成像结果（空间分辨率：15 μm） 小鼠小脑的高空间分辨率分析对小鼠小脑附近的区域进行高空间分辨率质谱成像分析，如图2（a）中红色部分所示。根据表1中的分析条件，空间分辨率为5 μm。如图所示，可在m/z 885.557处获得 PI (38:4)、在m/z 888.631处获得硫苷脂(C24:1)，检测到更清晰更详细的质谱图像（图3(b)和(d)）。 此外，由于iMScope QT的质量准确度和分辨率较高，能够分离和检测PI (38:4)的同位素（m/z 888.573）和硫苷脂(C24 :1)（m/z 888.631），并能提取每种同位素的质谱图像（图3(c)和3(d)）。而iMScope TRIO则无法获得以上结果。 图3 小鼠小脑的光学图像和质谱图像（空间分辨率：5 μm） (a) 光学图像(b) PI (38:4)的质谱图像，m/z 885.557(c) PI (38:4)同位素的质谱图像，m/z 888.573(d) 硫苷脂(C24:1)的质谱图像，m/z 888.631 结论与iMScope TRIO相比，iMScope QT的分析范围更广，分析速度更快，可实现更广泛的快速成像分析。此外，随着检测准确度和分辨率的提高，能够对各种目标化合物进行高精确度、高特异性的质谱成像分析。 iMScope QT不仅整合了质谱和形态学分析，而且能够在更广泛的领域实现更快速、更灵敏以及更高的空间分辨率的检测。 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 8月10日23点， i Nature Biotechnology /i 在线发表了由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室研究员王凯研究组完成的题为《共聚焦光场显微镜对小鼠和斑马鱼大脑快速体成像》的研究论文。该研究发展了一种新型体成像技术：共聚焦光场显微镜(Confocal light field microscopy)，可以对活体动物深部脑组织中神经和血管网络进行快速大范围体成像。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 跨脑区大规模的神经元如何整合信息并影响行为是神经科学中的核心问题，解答这一问题需要在更高时空分辨率上捕捉大量神经元活动动态变化的工具。共聚焦显微镜和双光子显微镜等运用于活体脑成像的传统工具基于点扫描，时间分辨率较低，难以研究大范围脑区中神经元的快速变化。因此，近年来科研人员一直致力于开发更快的成像方法。在多种新技术中，光场显微镜具有潜力，得到广泛关注，其特点在于可以在相机的单次曝光瞬间，记录来自物体不同深度的信号，通过反卷积算法重构出整个三维体，实现快速体成像，在线虫、斑马鱼幼鱼等小型模式动物上已获得初步应用。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 传统光场显微镜存在两个难以解决的问题，限制了其在生物成像上的应用。首先，重构的结果会出现失真。2017年，王凯研究组研发的新型扩增视场光场显微镜（eXtended field-of-view Light Field Microscopy, XLFM）解决了这一问题，并应用于自由行为斑马鱼幼鱼的全脑神经元功能成像上，首次三维记录了斑马鱼幼鱼在完整捕食行为中的全脑神经元活动的变化。其次，现有光场显微成像技术缺乏光学切片能力，无法对较厚组织，如小鼠的大脑进行成像。让光场显微镜具有共聚焦显微镜一样的光学切片能力，滤除大样品中焦层之外的背景信号来提高信噪比，是提高成像质量、可广泛应用的关键所在。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 然而，传统共聚焦显微镜采用激光逐点扫描和共轭点针孔检测来降低焦面外噪声的策略不适用于三维光场显微镜。面对这一挑战，研究团队创新提出广义共聚焦检测的概念，使其可以与光场显微镜的三维成像策略结合，在不牺牲体成像速度的前提下有效滤除背景噪声，提高了灵敏度和分辨率。这种新型的光场显微成像技术称为共聚焦光场显微镜。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 研究团队在不同动物样品上测试了共聚焦光场显微镜的成像能力。团队成员对包埋的活体斑马鱼幼鱼进行全脑钙成像，对比共聚焦和传统光场显微镜的成像结果，发现加入光学切片能力后，图像分辨率和信号噪声比提高，可以检测到更多较弱的钙活动。进一步的，将共聚焦光场显微镜和高速三维追踪系统结合，对自由行为的斑马鱼幼鱼进行全脑钙成像，在ø 800 μm x 200 μm的体积内达到2 x 2 x 2.5 μm sup 3 /sup 的空间分辨率和6Hz的时间分辨率。受益于更高的分辨率和灵敏度，可以识别出斑马鱼幼鱼在捕食草履虫过程中单个神经元的钙离子活动的变化。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 团队成员验证了共聚焦光场显微镜对小鼠大脑的成像效果，对清醒小鼠的视皮层进行钙成像，可以同时记录ø 800 μm x 150 μm的体积内近千个神经元的活动，最深可达约400 μm，且连续5小时以上稳定记录超过10万帧，没有明显的光漂白。团队成员进一步尝试使用共聚焦光场显微镜对鼠脑中的血细胞进行成像，深度可达600 μm，拍摄速度70 Hz，同时记录上千根血管分支中群体血细胞的流动情况并计算血细胞的速度，相比之前的传统成像方法通量提高了百余倍。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 研究团队在自由行为的斑马鱼幼鱼和小鼠大脑上证明了共聚焦光场显微镜有更高的分辨率和灵敏度，为研究大范围神经网络和血管网络的功能提供了新的工具。同时，该技术不仅适用脑组织的成像，还可以根据所需成像的样品种类灵活调整分辨率、成像范围和速度，应用在其他厚组织的快速动态成像中。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 研究在王凯的指导下，主要由博士研究生张朕坤、白璐，以及助理研究员丛林共同完成。王凯研究组余鹏、张田蕾，中国科学技术大学本科生石万卓，杜久林研究组李福宁做出贡献，研究员杜久林参与合作并给予指导意见。研究得到中科院脑智卓越中心实验动物平台的支持。研究工作受到科技部、中科院、国家自然科学基金委员会和上海市的资助。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/9bfa0661-24ad-4d0d-9ccd-10db465617c7.jpg" title=" 图1.jpg" alt=" 图1.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图1.（上）共聚焦光场显微镜原理示意图。（下）不同于传统光场显微镜，共聚焦光场显微镜采用片状照明，选择性激发样本的一部分，在垂直照明的方向上扫描，采集到的信号被遮挡板过滤掉焦层范围之外的部分。对采集到的图像进行重构可以得到焦层内的三维信息。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/28e2bd6d-59f5-4ff1-8085-355f6d295cbf.jpg" title=" 图2.jpg" alt=" 图2.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图2.（左）斑马鱼幼鱼捕食行为的一个例子。0s 为斑马鱼吞食草履虫的时刻。（右）左图斑马鱼捕食行为中，共聚焦光场显微镜记录到的两个不同脑区的神经元活动。箭头所指为过程中激活的单个神经元。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/c26412e7-a408-4c67-8533-1c5a118fdb4b.jpg" title=" 图3.jpg" alt=" 图3.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(68, 68, 68) font-family: 微软雅黑 background-color: rgb(255, 255, 255) " 　 /span 图3.（左）共聚焦光场显微镜拍摄得到的小鼠视皮层中的复杂血管网络。6个在不同深度拍摄的体积连接为一个深度达600 μm的三维结构。（中）100 μm到250 μm深度血管网络的平面投影，颜色代表不同血管分支中血细胞的平均流速。（右）图中箭头所指的区域中五个血管分支在一段时间内流过血细胞数量的计数。 /p

在哺乳动物的大脑中，许多不同类型细胞形成复杂的相互作用网络，从而实现广泛的功能。由于细胞的多样性和复杂的组织，人们对大脑功能的分子和细胞基础的理解受到了阻碍。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞表观基因组分析的发展使发现大脑中许多分子上不同的细胞类型成为可能[1，2]。然而，这些研究中有限的样本量可能导致对大脑细胞多样性的低估。此外，了解大脑功能背后的分子和细胞机制不仅需要对细胞及其分子特征进行全面的分类，还需要详细描述分子定义的细胞类型的空间组织和相互作用。在更精细的尺度上，细胞之间的空间关系是通过相邻分泌和旁分泌信号传递的细胞间相互作用和通信的主要决定因素。虽然突触通信可以发生在细胞体相距较远的神经元之间，但神经元和非神经元细胞之间的相互作用以及非神经元细胞之间的相互作用通常借助直接的体细胞接触或旁分泌信号，因此需要细胞之间的空间接近。而且涉及局部中间神经元的相互作用也倾向于发生在空间近端神经元之间。因此，一个高空间分辨率的全脑细胞图谱对于理解大脑的功能极其重要。来自美国哈佛大学的庄小威教授课题组使用多重误差鲁棒荧光原位杂交（MERFISH）技术对整个成年小鼠大脑中大约1000万个细胞中的1100多个基因进行了成像，并通过整合MERFISH和scRNA-seq数据，在全转录组尺度上进行了空间分辨的单细胞表达谱分析。研究人员在整个小鼠大脑中生成了5000多个转录不同的细胞簇（属于300多种主要细胞类型）的综合细胞图谱，将该图谱与小鼠大脑共同坐标框架进行定位，可以系统量化单个大脑区域的细胞类型组成和组织，并进一步确定了具有不同细胞类型组成特征的空间模块和以细胞渐变为特征的空间梯度。这种高分辨率的细胞空间图—每个细胞都具有转录组表达谱，有助于推断数百种细胞类型对之间的细胞类型特异性相互作用和预测这些细胞-细胞相互作用的分子（配体-受体）基础和功能。总之，此研究不仅为大脑的分子和细胞结构提供了丰富的见解，而且为其在健康和疾病中的神经回路和功能障碍奠定了基础。该结果于近日发表在Nature上，题为“Molecularly defined and spatially resolved cell atlas of the whole mouse brain”。研究小组通过MERFISH技术对横跨4只成年小鼠（1雌3雄）大脑整个半球的245个冠状面和矢状面切片上进行成像，根据DAPI和总RNA信号，单个RNA分子被识别并被分配到细胞，进而得到单个细胞的表达谱。总之，该研究对成年小鼠大脑中大约1000万个细胞进行成像和分割，包括11个主要的大脑区域：嗅觉区、等皮层（CTX）、海马形成、皮质底板（CS）、纹状体（ST）、苍白球、丘脑、下丘脑（HT）、中脑、后脑和小脑。基于典型相关性分析整合MERFISH数据和scRNA-seq数据，采用K最近邻(k-NearestNeighbor,KNN)分类算法对MERFISH细胞进行分类。为了对不同大脑区域的细胞类型组成和组织进行系统定量，他们将MERFISH生成的细胞图谱注册到艾伦脑科学研究所发布的小鼠脑三维图谱第三版（Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework，CCFv3）[3]，可将每个单独的MERFISH成像细胞及其细胞类型身份标签放入3D CCF空间（图1）。图1 对整个小鼠大脑的分子定义和空间分辨的细胞图谱（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）据统计，整个小鼠大脑由46%的神经元和54%的非神经元细胞组成，神经元细胞与非神经元细胞的比例在后脑中最低、在小脑中最高。神经元细胞包括315个亚类和超过5000个集群，其类型也表现出很强的区域特异性，大多数神经元亚类仅在11个主要区域中的一个区域富集。这11个主要区域包含了不同数量的细胞类型，尤其是后脑、中脑和下丘脑所包含的神经元细胞类型的数量以及局部复杂性远远高于其它大脑区域。基于神经递质转运体和参与神经递质生物合成相关基因的表达，他们将成熟的神经元分为8个部分重叠的组别。其中，谷氨酸能神经元和γ-氨基丁酸（GABA）能神经元分别约占神经元总数的63%和36%，谷氨酸能与GABA能神经元的比例在不同的大脑区域中差异很大，而5-羟色胺（5-HT）能、多巴胺能、类胆碱能、甘氨酸能、去甲肾上腺素能和组胺能神经元仅占神经元总数的2%（图2c）。谷氨酸能神经元和GABA能神经元广泛分布于全脑，可分为具有不同空间分布的不同细胞类型；在谷氨酸能神经元中，Slc17a7（Vglut1）、Slc17a6（Vglut2）和Slc17a8（Vglut3）在不同的脑区分布存在差异，Slc17a7主要位于嗅觉区、CTX、海马形成、CS和小脑皮层，而Slc17a6主要位于HT、中脑和后脑（图2d，e）。他们还观察到两个未成熟神经元（IMNs）亚类：一种是抑制性的，一种是兴奋性。抑制性IMNs由30个簇组成，沿脑室下区（SVZ）分布，通过前连合处延伸至嗅球；兴奋性IMNs由七个簇组成：簇516主要位于嗅觉区域，而其它簇沿海马体形成的齿状回分布（图2f），这与之前关于海马形成中成人神经发生的发现一致[4]。图2 神经元细胞的类型和空间分布（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）非神经元细胞包括23个亚类和117个簇。通过量化，研究小组发现在整个大脑中，非神经元细胞由30%少突胶质细胞、6%少突胶质细胞前体细胞（OPCs）、28%血管细胞、23%星形胶质细胞、8%免疫细胞和5%其它类型细胞组成。一些非神经元细胞类型，特别是星形胶质细胞和心室系统中的细胞也表现出很强的区域特异性。星形胶质细胞包括36个细胞簇，最大的两个集群Astro 5225和Astro 5214，分别占星形胶质细胞总数的48%和33%。基本上每个Astro星团都显示出独特的空间分布，Astro 5225只位于端脑区，Astro 5214只位于非端脑区，Astro 5215位于丘脑，Astro 5216位于后脑，Astro5231-5236位于嗅球，Astro 5207位于小脑，Astro 5222位于齿状回，Astro 5208富集于靠近软脑膜表面的髓质，Astro 5228、5229和5230位于SVZ沿线，延伸至嗅球，并与抑制性IMNs广泛共定位（图3d）。少突胶质细胞在纤维束中富集，在整个脑干中十分丰富，而OPCs则均匀分布地整个大脑；在集群水平上，一些少突胶质细胞和OPCs也表现出区域特异性，如Oligo 5277在皮层中富集，而Oligo 5286在后脑中富集（图3e）。与心室系统相关的细胞也呈现区域特异性分布，在第三脑室，下丘脑室管膜—胶质细胞位于腹侧区域，而ependymal细胞占据背侧区域，Hypendymal细胞位于第三脑室背侧的下联合器，心室内的主要细胞是脉络膜丛细胞和血管软脑膜细胞（VLMCs）。除了VLMC 5301和VLMC 5302，大多数VLMC集群被限制在软脑膜（图3f）。图3 非神经元细胞的类型和空间分布（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）接下来，研究团队为每个细胞定义了一个局部细胞类型的组分矢量，并使用这些矢量聚类细胞，从而得到了包含相似邻域细胞类型组成的细胞的“空间模块”（图4a）。他们确定了16个一级空间模块和130个二级空间模块，一级空间模块将大脑分割成与CCF中定义的主要大脑区域基本相吻合的区域，一个显著的差异是中脑和后脑之间的边界（图4b，c）。许多2级空间的模块与CCF中定义的子区域一致，但观察到更多的差异（图4d）。此研究中的空间模块描述是基于单个细胞的转录组范围内的表达谱所定义的细胞类型，因此比CCF中脑区描述的信息具有更高的分子分辨率，空间梯度代表了对该区域的分子轮廓的更精确的描述。图4 空间模块：分子定义的大脑区域（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）考虑到在某些情况下，细胞的基因表达谱可能会表现出渐进或连续的变化，他们因此检查了所有的细胞亚类，结果发现细胞的空间梯度广泛分布在大脑的许多区域。例如，颅内（IT）神经元在整个CTX上形成了一个连续的梯度，在这个区域，基因表达沿皮层深度方向逐渐变化，但第2/3层IT神经元的分离更为明显（图5a）。在纹状体中，D1和D2中棘神经元均沿背外侧-腹内侧轴形成空间梯度（图5b，c）。在外侧间隔复合体（LSX）中，几个GABA能亚类沿着背腹轴形成了一个梯度（图5d）。在海马体的CA1、CA3和齿状回区域和中脑的下丘中也观察到空间梯度。他们也观察到了一些非神经元细胞之间的空间梯度，如下丘脑室管膜—胶质细胞，沿着第三脑室的背腹轴形成了一个连续的梯度（图5e）。通过基于UMAP（一致的多方面逼近和投影以进行降维）的基因表达可视化分析，他们发现一个大规模的跨越HT、中脑和后脑区域的空间梯度（图5f）。图5 分子定义的细胞类型的空间梯度（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）最后，他们分析了亚类水平上的细胞类型，并推断单个大脑区域中细胞类型特异性的细胞-细胞相互作用（包括非神经元细胞间，非神经元细胞和神经元之间以及神经元间）。几百对细胞亚类被确定，统计学结果显示有显著的相互作用。预测的大多数具有相互作用的细胞类型对包含多个配体-受体对，与同一细胞类型对中的非近端细胞对相比，近端细胞对的表达显著上调，为这些细胞间相互作用的分子基础提供了见解。在非神经元细胞之间，发现内皮细胞和周细胞均与大脑中的边缘相关巨噬细胞（BAMs）、巨噬细胞有显著的相互作用。在这两种情况下，与非近端细胞对相比，来自层粘连蛋白信号通路的配体-受体对在近端细胞对中均明显上调，一些细胞因子（内皮细胞中的Cytl1和周细胞中的Ccl19）在BAMs近端血管细胞中表达上调，这说明大脑中的血管细胞可能利用这些细胞因子来招募巨噬细胞（图6d，e）。小胶质细胞也被发现与内皮细胞、周细胞之间的显著相互作用；与内皮细胞相比，周细胞与小胶质细胞相互作用的可能性更高，而与BAMs相互作用的趋势则相反（图6f，g）。他们还观察到神经元和非神经元细胞之间的显著相互作用，例如星形胶质细胞和抑制性IMNs在嗅球中、星形胶质细胞和兴奋性IMNs在海马形成中表现出显著的相互作用。此分析也预测了一些神经元亚类之间的相互作用，例如，海马形成过程中Pvalb枝形吊灯状GABA神经元和CA3谷氨酸能神经元之间、IPN Otp Crisp1 GABA神经元和中脑的DTN-LDT-IPN Otp Pax3 GABA神经元之间的相互作用。图6 细胞间的相互作用和通信（图源：Zhang, M., et al.. Nature, 2023）文章结论与讨论，启发与展望通过MERFISH技术成像约1000万个细胞，并将MERFISH数据与全脑scRNA-seq数据集整合，该研究生成了一个具有高分子和空间分辨率的、横跨整个小鼠大脑的分子定义的细胞图谱。进一步将该图谱注册到了艾伦脑科学研究所发布的CCF中，提供了一个可被科学界广泛使用的参考细胞图谱，使科研人员能够确定每个大脑区域不同转录细胞类型的组成、空间组织和潜在的相互作用。一方面，非神经元细胞与神经元细胞或非神经元细胞之间的相互作用，以及配体-受体对、基因的相关上调，为测试不同非神经元细胞类型的功能作用提供了切入点。另一方面，将转录组成像与不同行为范式下的神经元活动成像相结合可以揭示神经元的功能角色[5]。未来的研究将结合空间分辨的转录组学分析和各种其它特性的测量（如表观基因组谱、形态学、细胞的连通性和功能、系统的基因扰动方法），将有助于大家阐述大脑的分子和细胞结构的功能和功能障碍在健康和疾病中的作用。MERFISH（Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization），一种空间分辨的单细胞转录组学方法，经过近年的发展已成为生命科学领域中最具有前景的单细胞测序技术之一。该技术独特的原理和方法,可实现对单细胞进行多重靶向探测,从而深入研究细胞的生物学特性,对于疾病诊治及药物研发等方面也有着广泛的应用价值。