人血清蛋白与干扰素

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry1，文章通讯作者是来自荷兰乌得勒支大学的Albert J. R. Heck教授。　　血清中大多数蛋白都是糖基化蛋白，这些糖蛋白对疾病诊断有着重要意义，基于质谱的糖链释放后分析和糖肽分析是目前普遍使用的糖蛋白分析方法，但仍存在一些局限，例如可能遗漏同时发生的翻译后修饰、缺乏对O-糖的研究、遗漏某些糖肽覆盖不到的糖基化位点等。高分辨非变性质谱为完整糖蛋白的分析提供了新的思路，本文开发了一种基于离子交换色谱的分离纯化方法，能够从150μL血清中分离和分析20多种血清(糖)蛋白，质量范围在30-190 kDa之间。　　图1为血清糖蛋白的分离和分析方法。150μL血清首先经过亲和柱以快速去除大量的白蛋白、IgG和血清转铁蛋白等，这一步骤使用的是作者内部制造的机器人，可以加快过柱子的速度。接着血清被送入离子交换(IEX)色谱，使用40分钟的梯度时，大多数蛋白在14-27分钟内洗脱，故作者在13-30分钟内每隔0.5分钟收集一次级分，并将每个级分缓冲液换为乙酸铵溶液，最后进行Thermo Exploris Orbitrap质谱仪分析。　　　　图1.血清糖蛋白非变性质谱分析方法　　作者使用该方法分离了大约24种血清蛋白，并在文中详细介绍了其中4种蛋白的分析过程：α-1抗胰蛋白酶、补体C3、血红素结合蛋白、铜蓝蛋白。　　(1)α-1抗胰蛋白酶(A1AT)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在呼吸系统的功能中起重要作用，作者使用唾液酸酶和PNGase F确认了蛋白上的糖型，又通过TCEP的还原处理发现大部分血清样品的A1AT都是半胱氨酸化的，也确认了A1AT存在N端截短的特征，综上，作者共统计出了13个A1AT异质体。针对捐献者提供的血清，作者区分出了携带V237A和E400D突变的A1AT蛋白的供体。　　(2)补体C3蛋白在免疫调节过程中发挥作用，在血清中浓度相对较高，分子量为187kDa。与该蛋白共流出的还有两种约137kDa和80kDa的蛋白，在唾液酸酶处理后，只有80kDa的蛋白质量减少很多，证明其存在唾液酸，而C3和137kDa蛋白的糖型上无唾液酸。通过对级分的糖肽分析确定N糖位点在Asn 63和Asn 917。137kDa蛋白鉴定为C3缺失α链后降解而成。　　(3)血红素结合蛋白(HPX)在血清中的主要功能是结合和运输游离的血红素，进行血红素和铁的再循环。非变性质谱显示HPX质量范围在58-63 kDa，而蛋白质主链质量仅50 kDa。本文首次解析了血清HPX的蛋白型谱，证明了4-5个N-糖和1个O-聚糖的存在，共17种独特的糖型。　　(4)铜蓝蛋白(CER)负责在人体内转运大部分的铜，分子量132kDa，每个CER分子可以携带6-7个铜离子。CER在非变性质谱检测后的分子量比理论质量多409±5Da，作者将其归为6个铜离子和1个钙离子的结合所致，并发现了CER完全去糖后失去结合金属离子的能力。　　　　图2.绘制血清糖蛋白组的全貌图。观察到的血清蛋白质量范围为30-190 kDa，浓度范围为0.2-50g/L　　总结：本文开发了一种从少量人血清中分离多种糖蛋白的方法，并通过高分辨非变性质谱表征了蛋白型谱，为蛋白全貌提供完整视图。该方法的优势在于非变性质谱需要的样品处理步骤少，最大程度的还原了蛋白的生理状态，劣势在于目前通过完整质量只解析了20余种蛋白中的8种，后续需要结合自下而上或自上而下的蛋白质组学方法进行辨别。在未来的研究中，作者建议联用分子排阻色谱和离子交换色谱，实现高通量在线血清蛋白分离分析。　　撰稿：英语佳 编辑：李惠琳　　原文：Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry

当前，新型冠状病毒肺炎(COVID-19)仍在全球范围内持续威胁着人类的健康，截止到2021年6月初，新冠肺炎确诊病例已多达1.72亿，死亡人数超过370万。新冠爆发早期的研究主要集中在探索流行病学和发病机制上，随着人们对新冠病毒的认识逐渐加强，越来越多的临床专家开始关注新冠康复患者的预后评估。此前有研究指出新冠肺炎康复患者会持续出现不同程度的症状和意想不到的实质性器官功能障碍，然而这些后遗症发生的分子机制尚未明确。　　近日，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心黄超兰教授团队，和浙江大学第一附属医院郑敏教授团队开展合作研究，首次关注新冠肺炎康复患者的血清蛋白表达变化。通过蛋白质组学数据与临床数据的整合分析，提出康复患者在1个月后仍会出现胆固醇代谢紊乱和心肌受损。该研究以“Proteomic analysis identifies prolongeddisturbances in pathways related to cholesterol metabolism and myocardiumfunction in the COVID-19 recovery stage”为题于2021年6月3日线上发表在Journal of Proteome Research期刊上。　　图. 基于DIA-PASEF方法的定量蛋白质组学分析　　研究者对来自健康志愿者，COVID-19中症及重症病人的患病期和康复期的血清样本开展了基于DIA-PASEF方法的定量蛋白质组学分析。结果显示，与健康对照组相比，康复期的中症和重症患者体内分别有243和163个蛋白质发生了显著变化，其中，与患病期重合的蛋白数量分别为113和88个。进一步的研究结果表明，康复患者体内未恢复至正常水平的蛋白主要参与了胆固醇代谢、转运、酯化，及心肌肥大、心肌组织发育、心肌细胞分化、心血管系统发育等相关通路。值得关注的是，通过系统地统计600名新冠肺炎患者、1177名甲型流感患者和522名H7N9感染患者的总胆固醇水平数据，研究者发现仅新冠肺炎患者的血清总胆固醇在发病后呈上升趋势。相关研究结果有助于进一步探索针对新冠肺炎康复患者的临床治疗决策设计，未来有效改善患者的预后。本研究基于前沿的高通量DIA定量蛋白质组学技术，用高质量的数据为全面开展新冠康复患者的预后评估提供了可靠的重要分子基础和机制信息。此前，黄超兰主任领衔的多组学中心团队还与高福院士领衔的多学科团队紧密合作，揭示早期的新冠感染患者存在显著的免疫抑制，并首次提出COVID-19的发病机制或存在“两阶段”模式。多组学中心在黄超兰教授的带领下，将继续基于临床，前沿技术和基础学科的深度交叉融合，开展协同创新研究，持续为抗击新冠病毒做出多方面的贡献。 北京大学医学部精准医疗多组学研究中心主任黄超兰教授，浙江大学第一附属医院郑敏教授为本文的共同通讯作者 北京大学医学部精准医疗多组学研究中心陈扬副研究员，浙江大学第一附属医院姚航平研究员，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心博士研究生张楠，浙江大学第一附属医院吴杰副研究员为本文的共同一作。　　原文链接：　　https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.1c00054

p 　　中国工程院院士、中国医学科学院院长曹雪涛团队日前发现，甲基转移酶分子SETD2能够显著增强干扰素的抗病毒效应，促进机体抵抗病毒能力，提高干扰素疗法清除乙肝病毒效果。该发现为抗病毒免疫应答效应机制提出了新观点，也为有效防治病毒感染性疾病提供了新思路。相关成果发表于新一期《细胞》杂志。 /p p 　　干扰素是机体抵抗病毒感染的关键性细胞因子，可通过激活免疫细胞内信号通路而诱导出一系列抗病毒效应分子，从而激活和维持免疫系统抗病毒能力。干扰素是目前临床治疗乙型肝炎的常用药物之一，然而其疗效有限，因此，揭示干扰素抗病毒效应的具体机制以寻找有效防治病毒感染的新型免疫措施具有重要意义。在国家基金委、科技部973项目等资助下，曹雪涛院士与浙江大学医学院免疫学研究所陈坤博士以及第二军医大学医学免疫学国家重点实验室联合攻关，针对表观遗传机制参与免疫应答过程与免疫性疾病发生，而目前尚不清楚表观遗传分子如何调控干扰素抗病毒免疫功能这一重要科学问题，通过高通量RNA干扰筛选体系分析了700余种表观遗传酶分子在干扰素抑制乙肝病毒中的作用，发现了甲基转移酶分子SETD2对于干扰素抑制乙肝病毒复制至关重要。通过制备肝细胞特异性敲除SETD2基因小鼠模型的体内实验，证实SETD2能显著增强干扰素抑制乙肝病毒以及其他多种病毒复制的体内效应。机制研究表明，SETD2分子通过其甲基转移酶活性，直接催化干扰素关键性信号蛋白分子STAT1的第525位赖氨酸发生单甲基化修饰(STAT1-K525me1)，从而促进干扰素效应信号的活化，诱导出更高水平的抗病毒蛋白，发挥更强抗病毒效应。 /p p 　　该研究揭示了甲基转移酶SETD2分子能够直接诱导干扰素信号蛋白分子的甲基化并促进干扰素抗病毒效应的重要功能，表明该发现丰富了人们对于机体抗病毒免疫调控机制的认识也为下一步开展相关研究提供了新思路。鉴于干扰素信号调控异常与炎症性疾病、慢性感染疾病发生发展等密切相关，该研究也为研发抗病毒、抗炎药物提供了潜在靶标，为干扰素临床应用方案的优化提供了新方向。 /p p /p