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一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。2. 通过测定蛋白质分子量的训练,初步掌握凝胶层析技术。二、实验原理凝胶层析又称排阻层析,凝胶过滤,渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等,而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质,主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子(近于球形)具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分离原理参见“理论部分的凝胶层析一节”。对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外;而一些小分子不被排阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔,尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小,进入凝胶内部越深,所走的路程越多,故小分子最后流出柱外,而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间,只能进入一部分凝胶较大的孔隙,亦即部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离的目的。凝胶层析分离原理示意动画。对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间,其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav(分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示,Kav值的大小和凝胶柱床的总体积(Vt)、外水体积(V0)以及分离物本身的洗脱体积(Ve)有关:Kav = (Ve-V0)/(Vt-V0) ----------- (1)在限定的层析条件下,Vt和V0都是恒定值,而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。分子量大,Ve值小,Kav值也小。反之,分子量小Ve值大,Kav值大。有关凝胶层析柱中凝胶自身(基质)体积(Vg)、外水体积(V0)、内水体积(Vi)及柱床总体积(Vt)的参见示意图。凝胶层析柱中的几种层析峰。有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数,同时也是测定蛋白质分子量的一个依据。在相同层析条件下,被分离物质Kav值差异越大,分离效果越好。反之,分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中,我们可以实测出Vt、V0及Ve的值,从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶,在一定的分子量范围内,Kav与logMw (Mw表示物质的分子量) 成线性关系:Kav =-b logMw + C --------- (2)其中 b,C为常数。同样可以得到:Ve =-b'logMw + C' --------- (3)其中 b', C'为常数。即 Ve 与 logMw 也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质后,并根据上述的线性关系绘出标准曲线,然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。三、器材与试剂(一)器材1. 玻璃层析柱((20mm×60cm)2. 恒流泵(或下口恒压贮液瓶)3. 自动部分收集器4. 紫外分光光度计5. 100ml试剂瓶6. 1000ml量筒7. 250ml烧杯8. 50ml、100ml烧杯9. 10ml(或5ml)刻度试管(二)试剂1. 标准蛋白(1)牛血清白蛋白:Mw=67,000(上海生化所)(2)鸡卵清清蛋白:Mw=45,000(美国SIGMA公司)(3)胰凝乳蛋白酶原A:Mw=24,000(美国SIGMA公司)(4)溶菌酶:Mw =14,3002. 未知蛋白质样品:由实验室准备3. 0.025M KCl-0.1M HAC(乙酸)(洗脱液1000ml)4. 蓝色葡聚糖-2000
在一定的温度下,同一化学物质在不相混溶的两种介匝间分布达平街时.该物质在这两种介质中的浓度比是一常数.称分配系数。不同化学物质的分配系数不同。层析法即利用混合物中各组分的分配系数不同而崖其分离的方法。其两种介质,一为固定不动,称固定相,另一为可相对流动,称流动相。 层析法已广泛应用在生物化学领域中,无论是少量分析还是大量制备,都能体现出它的高效性,简便性等特点。在实脸室中的常用层析法有:凝胶过滤,纸层析.薄层层析,离子交换层析,亲和层析,高效液相层析等。 以下介绍几种常用的层析法凝胶过滤 凝胶过滤的别名很多,如凝皎扩散层析,分子筛层析,排阻层析等。这种技术具有操作简便,回收率高(近100%),条件缓和等特点,但它的分离操作速度较慢。该法常用于蛋白质,多糖,核酸的分离纯化。 凝胶过滤的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。柱的总体积为VA,它包括填料的骨架体积VGM。,填料的孔体积Vi(内水体积)及填料颗粒间的体积VO(外水体积)。分布在填料的孔中的溶剂是固定相,分布的填料颗粒间的溶剂是流动相。填料颗粒含有许多不同大小的孔.如果待分离的物质分子大小合适,则可以不同程度地向孔中扩散,大分子物质只能占有较少的大孔,小分子则能占有大孔及另外一些小孔。所以当不同分子量物质的混合物流经凝胶柱时,较小的分子在柱中停留的时间比大分于停留的时间长,于是混合物中各组分即按分于大小分开,最先流出的是最大的分子。示意图如下所示,http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010171831_251966_1638724_3.jpg用于生物材料分离的凝胶主要有交联葡聚糖凝胶(商品名为Sephadex),聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Bio—Gel),琼脂糖凝胶(商品名Sepharose)等。如常用的交联葡聚糖是将葡聚糖(Dextran)悬浮于有机溶剂,加入交联剂表氯醇交联聚合而成多糖链的三维结构,这种聚合物为白色珠状微粒,是多孔性网状结构,凝胶的孔径大小与交联剂的量有关,交联剂多则交联度大,网状结构紧密,孔径小,反之交联剂少则孔径大。 将含有三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。首先将样品小心自柱顶端加入,洗脱,以分步收集器收集洗脱液,测定每管物质浓度,然后以洗脱体积为横坐标,各物质浓度为纵坐标即得如下的洗脱曲线:由图可见最先流出的物质是,A,它的分子量最大,大于该种凝胶的排阻限(A物质分子的直径大于凝胶的孔径),完全不能进入颗粒内部,只能从颗粒间隙流过,称“全排阻”。其流经体积最小,与外水体积VO相等。最后流出的物质是C,它的分子量最小,小于该种凝胶的渗入限,其分子可以自由进出凝胶颗粒,这叫“全渗入”。流经体积是外水体积VO与内水体积Vi的和。而物质B的分子量介于排阻限与渗入限之间,其分子能够部分地进入凝胶颗粒之中,不能全部地不受限制的通过,这叫做“部分排阻”或“部分渗入”。它的流经体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分,即 Ve=VO+KdVi式中Kd称作“排阻系数”或“分配系数”。它反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度。Kd=(Ve-VO)/Vi当Kd=1时,Ve=VO+Vi为全渗入。当Kd=0时,Ve=VO为全排阻。当0t,则说明该物质分子与凝胶有吸附作用。这三种物质的分离过程可见示意图如下:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010171832_251967_1638724_3.jpgVi也可通过计算求出:Vi=aWra=凝胶千重Wi=每克干凝胶吸水毫升数Vt=Vo+Vi+VgVg=凝胶骨架体积Vt=可通过测定层析柱内径及高度计算得出:Vt=1/4D2h下表为交联葡聚糖凝胶的种类和规格:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010171832_251968_1638724_3.jpg
[转贴]凝胶层析法技术简介凝胶层析法技术凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体,不带电荷,吸附力弱,操作条件比较温和,可在相当广的温度范围下进行,不需要有机溶剂,并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。 1. 凝胶的选择 根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开,由于它们在分配系数上有显著差异,这种分离又称组别分离,一般可选用Sephadex G-25和G-50,对于小肽和低分子量的物质(1000-5000)的脱盐可使用Sephadex G-10,G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离,这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶,层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部,由于Kd不同,最后得到分离。 2. 柱的直径与长度 根据经验,组别分离时,大多采用2-30cm长的层析柱,分级分离时,一般需要100cm左右长的层析柱,其直径在1-5cm范围内,小于1cm产生管壁效应,大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间,但对移动慢的物质宜在30-40之间。 3. 凝胶柱的制备 凝胶型号选定后,将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀,溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长,加热可使溶胀加速,即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸,1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 凝胶的装填:将层析柱与地面垂直固定在架子上,下端流出口用夹子夹紧,柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器,柱内充满洗脱液,将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中,然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内,这样凝胶粒水平上升,直到所需高度为止,拆除柱顶装置,用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间,再开始流动平衡,流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速,千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜,使用前要检查层析床是否均匀,有无“纹路”或气泡,或加一些有色物质来观察色带的移动,如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好,色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。 4. 加样和洗脱 凝胶床经过平衡后,在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和,再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5%-10%。样品浓度与分配系数无关,故样品浓度可以提高,但分子量较大的物质,溶液的粘度将随浓度增加而增大,使分子运动受限,故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。样品加入后打开流出口,使样品渗入凝胶床内,当样品液面恰与凝胶床表面相平时,再加入数毫升洗脱液中洗管壁,使其全部进入凝胶床后,将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连,预先设计好流速,然后分部收集洗脱液,并对每一馏份做定性、定量测定。 5. 凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存 一次装柱后可以反复使用,不必特殊处理,并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌,可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠,在下次层析前应将抑菌剂除去,以免干扰洗脱液的测定。 如果不再使用可将其回收,一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干,依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90%以上,滤干,再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性,密封后高压灭菌保存。 6. 凝胶层析的应用 ⑴ 脱盐:高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质,可以用凝胶层析法除去,这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15,样品体积可达柱床体积的25%-30%,为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上,一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡,然后加入样品,再用同样缓冲液洗脱,收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。 ⑵ 用于分离提纯:凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力,可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。 ⑶ 测定高分子物质的分子量:用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内,在同一条件下层析,记录每一分钟成分的洗脱体积,并以洗脱体积对分子量的对数作图,在一定分子量范围内可得一直线,即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时,可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后,根据物质的洗脱体积,在标准曲线上查出它的分子量。⑷ 高分子溶液的浓缩:通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中,这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中,而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外,再经离心或过滤,将溶胀的凝胶分离出去,就得到了浓缩的高分子溶液。