联吡啶复合物

作为生命活动的执行者，蛋白质通过相互作用形成复合物等形式行使其特定的生物学功能。近日，中国科学院大连化学物理研究所研究员张丽华、研究员赵群等研制了一种基于糖苷键的质谱可碎裂型交联剂，显著地提高了交联信息的检索通量和鉴定准确度，同时具有良好的两亲性和生物兼容性，实现了活细胞内蛋白质复合物原位交联和规模化精准解析。相关成果发表在《德国应用化学》上。大连化物所供图　　细胞内的限域效应、拥挤效应和细胞器微环境等对于维持蛋白质复合物结构和功能至关重要。而化学交联技术，尤其是原位化学交联质谱技术具有规模化分析蛋白复合物原位构象和相互作用界面的优势，已成为活细胞内蛋白质复合物解析的重要技术。但是，目前活细胞原位交联面临着细胞扰动大、交联肽段谱图复杂程度高等问题。因此，如何实现活细胞低扰动下的原位快速交联是蛋白质原位构象和相互作用精准解析的先决条件。　　本工作中，团队基于糖分子的高生物兼容性和糖苷键的质谱可碎裂特征，将糖苷键引入到功能交联剂的骨架设计中，筛选并获得了高生物兼容性的海藻糖作为骨架分子，研制了质谱可碎裂型交联剂——海藻糖二琥珀酰亚胺酯。该交联剂较目前已报道的可透膜型化学交联剂，展示了更加优异的细胞活性维持能力，可在低扰动状态下实现细胞内蛋白质复合物的高效交联。　　在此基础上，低能量的糖苷键—高能量的肽键的质谱选择性碎裂模式，可以将“工字形”的交联肽段数据分析降幂为常规交联剂片段修饰的线性肽段数据检索，极大地降低了交联肽段谱图分析的复杂性，显著地提高了交联肽段的鉴定效率与准确度。

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Analytical Chemistry上文章，High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry1。该文章的通讯作者是美国基因泰克公司的Wendy Sandoval研究员。　　癌症疫苗是通过利用肿瘤细胞相关抗原，来唤醒人体针对癌症的免疫系统。常见的策略是通过对病人的肿瘤细胞样本进行基因测序来寻找特征性抗原肽，该抗原肽会与I类主要组织相容复合体(MHCI)相结合并呈递至CD8+细胞表面，通过与CD8+细胞表面受体相结合从而诱导免疫反应。为了实现整个过程，研究人员通常会结合基因测序和计算机预测结果设计多个候选抗原肽，每个候选肽都需要通过实验测试来确认它与MHCI分子的结合能力以及相关免疫原性。此外，考虑到编码MHCI的基因具有多态性，候选抗原肽还需要与不同等位基因编码的MHCI分子进行测试。因此，本文开发了一种高通量方法，利用非变形质谱快速筛选候选抗原肽并表征形成的肽-MHCI复合物(pMHCI)。　　pMHCI复合物中抗原肽的体外载入一直以来都是难点，因为MHCI复合物(包括HLA和β2M亚基)本身并不稳定，需要长度为8~10的多肽链载入到MHCI的凹槽以保持完整。本文则通过利用紫外光裂解肽-MHCI复合物(UV-MHCI)的肽交换实现抗原肽的载入，具体步骤如图1A所示，通过紫外光照，UV-MHCI中的高亲和肽被切割转为低亲和肽段，该低亲和力肽段极易发生肽交换，通过监测新的pMHCI复合物的形成实现对候选肽的评估。目前常用的检测pMHCI形成的工具包括ELISA、TR-FRET以及2D-LC-MS。然而这些方法仅能提供有限的信息关于肽交换、pMHCI分子质量，对形成的pMHCI复合物无法进一步的表征。事实上，pMHCI复合物对后续诱导免疫反应至关重要。　　图1. 癌症疫苗的免疫监测的示意图：A) 筛选流程，B检测方法。　　为了确认非变性质谱(nMS)能否用于pMHCI复合物表征以及肽交换率的检测，作者对UV-MHCI以及6个标准肽段进行了考察(图2)。未经UV照射的UV-MHCI MS谱图(图2A)可以观察完整的UV-MHCI复合物以及丢掉紫外光裂解肽的MHCI。MHCI复合物被认为是气相解离产生的，因为没有活性肽的稳定作用，MHCI很难存在于溶液相中，溶液中没有MHCI，“空壳”的MHCI只有可能是质谱中UV-MHCI的气相裂解产生的。图2B证实了这一观点，经紫外光照射后，紫外光裂解肽由高亲和力转为低亲和力，从MHCI上脱落，MHCI解离成HLA和β2M亚基，谱图中能观察到HLA和β2M亚基信号。确认了MHCI是由peptide-bound population产生的信号，作者开始用该方法去定量标准肽的肽交换率。如图2C为UV-MHCI与标准肽孵育并过夜UV照射得到的谱图，仅观察到完整的pMHCI以及“空壳”MHCI的信号，说明实现了100%的完全肽交换。如图2D，肽交换率随孵育时间改变，2小时孵育时间足以实现最大肽交换。　　图2. nMS表征UV光照A)前B)后的UV-MHCI复合物，C)nMS测定UV-MHCI与标准肽的肽交换率，D)标准肽肽交换率随时间的变换情况。　　为了提高分析通量，减少样本消耗，作者在nMS基础上开发了SEC-nMS和CZE-nMS系统。作者用SEC-nMS系统测定了50个候选肽的交换率，说明该系统能够进行中或大规模的数据采集。相比较SEC-nMS而言，CZE-nMS系统具有更高的灵敏度和通量，样品体积消耗从微升减少至纳升，分析时间也缩短为2 min(图3A)。检测信号与进样量呈线性关系，注射体积为3 nL时，最低检测限为6 ng(图3BCD)。作者测定了67个候选肽跨越4种等位基因编码的MHCI分子的肽交换率(图3E)。此外，通过将UV-MHCI复合物同时与四种以上的候选肽进行孵育可在单个实验中同时检测它们的相对肽交换率以及与MHCI结合的亲和力(图3F)。作者还提出Vc50这个概念，即导致50%的pMHCI复合物发生解离的碰撞电压，可作为评估pMHCI复合物稳定性的重要参数。　　图3. 使用CZE-MS系统高通量分析pMHCI复合物　　除了检测pMHCI复合物的形成，测定肽交换率，nMS还可以对形成的复合物进行进一步的结构表征。如图4所示，native top-down的分析策略可获得多层次的结构信息。本文使用的Orbitrap Eclipse “Tribrid” 质谱，图4A为完整pMHCI的MS1谱图，图4B为施加源内电压(SID)促使蛋白解离为亚基，图4C是将14+ pMHC单独分离出，为后续HCD活化做准备。图4D为pMHCI复合物经HCD解离后的MS2谱图。图4E和图4F则分别为对肽段以及HLA亚基进行top-down测序的结果。这些多层次的结构信息能够帮助区分HLA亚型、阐明候选肽的序列，包括一些PTMs、二硫键信息。这些结构细节可能会影响候选肽与MHCI分子间的亲和力甚至是后续T细胞受体的识别。　　图4. Native top-down分析策略获得pMHCI复合物的多层结构信息　　总之，本文将非变性质谱(nMS)与分子排阻(SEC)或毛细管电泳(CZE)分离技术相结合用于高通量筛选pMHCI复合物中的候选肽。该方法能够直观确认pMHCI的完整性，Vc50可作为评估复合物气相稳定性的重要指标，通过native top-down分析策略可获得多层次的结构信息。以上所有确保了后续临床T-细胞实验的正常进行。　　撰稿：刘蕊洁　　编辑：李惠琳　　原文：High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry　　参考文献　　1. Schachner LF, Phung W, Han G, et al. High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 10.1021/acs.analchem.2c02423. doi:10.1021/acs.analchem.2c02423

前言 /PROTAC表征难题重要靶点和候选药物的亲和力筛选非常具有挑战性。当您的亲和力筛选项目涉及到PROTAC二元和三元复合物，片段化合物库及固有无序蛋白时，需要进行样品固定的SPR技术和样品消耗量大的ITC技术的检测难度会大大增加，而这些应用则是Dianthus所擅长的。光谱位移技术（Spectral Shift）光谱位移技术是通过荧光发射光谱的蓝移或红移来检测分子间的结合。Dianthus可以为您解决哪些表征难题？Dianthus是一个基于微孔板的亲和力筛选平台，使您能够克服其他生物物理方法带来的挑战。避免这些常见的障碍，让您的PROTAC项目继续推进。1通过固定二元复合物的方法来进一步研究三元复合物，二元复合物的稳定性会受到影响。答Dianthus直接在溶液内进行检测，结合平衡状态可控。因此，在表征三元结合的过程中二元复合物可保持稳定。2在再生过程中，共价分析物几乎不可能从传感器芯片上完全去除。答在单独的孔中直接在溶液中检测分子间相互作用，使得您的亲和力分析更简单、无压力且更经济实惠。3其他检测方法难以测量warheads这样的小分子的亲和力。答光谱位移技术不依赖于分子量，因此您可以使用 Dianthus 对片段化合物进行初步筛选，还可以在后续亲和力优化中筛选PROTAC 候选物。4靶点和配体的样品量有限答使用Dianthus进行亲和力筛选无需耗费时间进行大量方法开发，检测时的样品消耗量很低，将极大节省所有的样品量。选择Dianthus表征PROTAC候选物Dianthus 是基于微孔板且无微流体系的亲和力筛选平台，您可通过 gRPC 框架轻松将其集成到任何自动化设置中。无需定期维护，您的项目不会因停机而延迟。Dianthus 随时准备好为您效劳 —— 7天24小时不间断。点击图片下载PROTAC电子书，了解更多技术难题