发展历程

近期我们梳理了分子诊断技术中测序部分，测序技术根据样本类型不同包含：DNA测序、RNA测序、单细胞测序、甲基化测序等。本期开始我们将从以下几个方面逐一介绍单细胞测序技术：单细胞测序技术概念及发展历程、单细胞测序技术操作流程、单细胞全基因组测序技术、单细胞全转录组测序技术、单细胞测序技术的应用。单细胞测序技术单细胞测序（Single cell sequencing，SCS）技术是指在单个细胞水平上对转录组或基因组进行扩增并测序，以检测单细胞在基因组学、转录组学、表观组学和蛋白组学等多个组学的数据。主要涉及：单细胞基因组测序、单细胞转录组测序和单细胞表观基因组测序。单细胞基因组测序（图1A）：是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序，用于揭示单细胞中的遗传变异，如单核苷酸变异（SNVs）、拷贝数变异（CNVs）和基因组结构变异（SVs），细胞群体差异和细胞进化关系。单细胞转录组测序（图1B）：是将分离的单个细胞的微量全转录组RNA进行扩增后进行高通量测序，用于在单细胞中生成基因表达、基因融合和选择性剪接的图谱，此技术被认为是截至 2020 年定义细胞状态和表型的金标准。[1]单细胞表观基因组测序（图1C）：是检测DNA序列不变的情况下表型的可遗传变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质可及性等。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶(5mC) 在基因组中广泛分布，并通过抑制转座因子在调节基因表达中发挥重要作用[2]。通过对单个细胞中的 5mC 进行测序，可以揭示来自单个组织或群体的遗传相同细胞的表观遗传变化如何产生具有不同表型的细胞。单细胞亚硫酸氢盐测序是DNA甲基化研究的金标准。图1 单细胞测序技术应用范围示意图[3]A:单细胞基因组测序应用范围；B:单细胞转录组测序应用范围；C:单细胞DNA甲基化测序应用范围；为什么要做单细胞测序呢？多细胞生物在细胞的分裂和分化过程中必然会带来不同细胞间的差异，形成遗传信息的异质性。传统的检测方法获得的信息来自于数百万甚至更多细胞的混合样本，因此得到的结果反映的是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，导致不同细胞间异质性信息被忽视。而单细胞测序可以检测单个细胞异质性、识别稀有细胞、揭示细胞间差异情况。[4]图2 单细胞测序（上）与传统混合细胞测序（下）对比示意图单细胞测序技术发展2009年汤富酬等完成首例哺乳动物单细胞RNA转录组测序后，单细胞测序经历了十几年突飞猛进的发展，同时，随着测序技术的更新迭代，各厂商基于不同检测原理开发出的单细胞分析系统不断推陈出新，单细胞测序逐渐实现了从低通量到高通量检测的转变。2017年“人类细胞图谱计划（Human Cell Atlas，HCA）”的正式公布，是高通量单细胞研究产业化的重要里程碑。图3 单细胞研究发展重大历程[5]单细胞测序技术流程最初单细胞测序是采用不同方法将单个细胞分离出来，独立构建成文库进行测序。但此法分离细胞通量低（仅检测数十个细胞且不足以反应真实情况）且成本较高。随着测序技术的发展，出现了基于标签（barcode）的单细胞识别技术，即不需要分离单个细胞，仅需对每个细胞加上单独的标签序列，通过一次建库测序即可，此方法使得单细胞测序进入了高通量时代，单细胞分离和测序的成本大大降低。与传统混合细胞测序不同的是，单细胞测序起始样本中核酸含量极低，需要对筛选出的细胞扩增后才能满足后期测序实验，目标是在尽量减少序列扩增偏差的前提下增加核酸总量利于后续分析。单细胞测序技术操作流程包括：样本细胞筛选、核酸提取及扩增、测序文库构建、测序和数据分析。图4 单细胞测序（上）与传统混合细胞测序（下）技术流程对比示意图参考文献[1] Tammela,Tuomas Sage,Julien (2020). "Investigating Tumor Heterogeneity in MouseModels". Annual Review of Cancer Biology. 4(1):99–119.doi:10.1146/annurev-cancerbio-030419-033413.[2] Zemach A, McDaniel IE, Silva P, Zilberman D (May 2010). "Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation". Science. 328 (5980): 916-9. Bibcode:2010Sci...328..916Z. doi:10.1126/science.1186366. [3] Jialong Liang , Wanshi Cai , Zhongsheng Sun.Single-Cell Sequencing Technologies: Current and Future[J].Journal of Genetics and Genomics 41 (2014) 513-528[4] Eberwine J, Sul JY, Bartfai T, Kim J ,The promise of single-cell sequencing[J]. Nature Methods. 2014,11 (1): 25–7. doi:10.1038/nmeth.2769[5] 基因慧《2020单细胞行研报告》

2024年是徕卡显微成立第175周年。这175年，既是徕卡品牌的发展历程，也是世界光学显微技术的发展史。这175年，徕卡始终满怀热忱，以创新将可视化、分析能力推向更高更远。徕卡的愿景是瞰见未知，赋能客户，同创世界健康与美好。让我们共同回顾徕卡品牌走过的百年风雨历程感受人类在光学显微技术领域的不断开拓创新1849 - 2004年品牌早期历程1849年德国数学家卡尔凯尔纳 (Carl Kellner) 博士在德国韦茨拉尔成立 Optical Institute 光学公司，开始镜头与显微镜的研究。早期的徕卡显微镜工厂1853年Optical Institute在美国成立 Bausch & Lomb 仪器部门。1865年恩斯特徕兹一世 (Ernst Leitz I) ，加入了公司并成为公司的合伙人。恩斯特徕兹一世 (Ernst Leitz I)1869年Ernst Leitz 接管“Optical Institute”并将公司改名为“Ernst Leitz”。早期的Leitz徕兹显微镜1872年Rudolf Jung在德国的海德堡成立精密工程公司。一个世纪以后，海德堡将诞生一家培养了十多位诺贝尔奖得主的全球著名研究所——欧洲分子生物学实验室EMBL（European Molecular Biology Laboratory）。鲁道夫荣格 (Rudolf Jung)1876年 C. Reichert在奥地利的维也纳成立光学公司。卡尔赖希特 (Carl Reichert)上述两家公司后来合并为Reichert-Jung。1881年霍勒斯达尔文 (Horace Darwin) 创立剑桥仪器光学公司 (Cambridge Instruments)，该公司也是徕卡集团的前身之一。而霍勒斯达尔文的父，亲，正是《物种起源》的作者，进化论的奠基人，英国生物学家查尔斯达尔文 (Charles Darwin)。霍勒斯达尔文 (Horace Darwin) 查尔斯达尔文 (Charles Darwin),进化论之父1907年徕卡将第10万台量产显微镜赠予诺贝尔奖获得者罗伯特科赫 (Robert Koch)。罗伯特科赫是德国科学家，因发现结核杆菌及细菌学相关研究而获得诺贝尔医学奖，被誉为“细菌学之父”。罗伯特科赫 (Robert Koch)徕卡赠送给罗伯特科赫的显微镜罗伯特科赫在使用徕卡显微镜1913年徕卡推出首台双目筒显微镜。首台双目筒显微镜1914年奥斯卡巴纳克 (Oskar Barnack) 发明 Leitz 35 mm 小画幅相机。由此开启了相机界的顶流——Leica徕卡相机的历史。第一台徕卡相机UR-LEICA1921年Wild Heerbrugg在瑞士创建光学公司。海因里希怀尔德 (Heinrich Wild)1925年徕卡推出首台偏光显微镜。1929年徕卡发布光子显微镜。1932年徕卡推出入射光荧光显微镜。1950年代的徕卡显微镜工厂1967年 徕卡发布图像分析产品 (定量分析显微镜) 。1972年Leitz Wetzlar 和 Wild Heerbrugg 开始合作。1976年公司拓展金属材料研究业务，并收购了达尔文创立的Cambridge Instruments（首家扫描电子显微镜制造商）。1981年Wild Leitz 集团开始规划成立。1984年ELSAM 超声显微镜荣获德国商业创新奖。1986年Ernst Leitz 和 Wild Heerbrugg 合并成立 Wild Leitz 集团。1990年Wild Leitz、Cambridge Instruments、Reichert & Jung 和 Bausch & Lomb 合并成立徕卡集团。1993年徕卡集团在中国设立第一家样本制备合资公司。1998年徕卡集团的徕卡相机、徕卡显微系统和徕卡测量系统三大业务单元成为三家独立公司。徕卡相机 徕卡显微系统徕卡测量系统2003年徕卡 DUV 物镜获得德国商业创新奖。2004年第一台超分辨率共聚焦 (4Pi) 显微镜。2005 - 2014年加入丹纳赫继续引领世界光学显微技术发展2005年徕卡显微系统正式加入美国丹纳赫（Danaher）集团，成为丹纳赫生命科学平台的一个重要分支。丹纳赫是全球科学和技术的创新者，徕卡与之携手，加速科技对今日生活之影响，改善人类健康。2005年大事记推出创新激光显微切割系统TCS SP5共聚焦显微镜面世，具备当时单台共聚焦显微镜有史以来最高的成像速度和分辨率AF6000 LX集成系统适用于高级宽场荧光成像和分析，使研究人员能够在几天内通过快速细胞动力学成像或 4D 实验来研究生命过程。徕卡 LMD6000 可处理较厚的样本和较硬的材料2006年大事记徕卡推出组织病理学网络解决方案徕卡显微系统公司第三次获得“Innovationspreis”（德国商业创新奖）2007年大事记徕卡与超高分辨率技术之父斯特凡黑尔 (Stefan Hell) ，推出超越当时显微分辨率极限的TCS STED 光学显微镜。这是世界首款商用STED显微镜，光学分辨率小于90纳米。Max Planck Innovation 签署 RESOLFT 技术的许可证协议；哈佛大学科技发展办公室向徕卡授予其 CARS 显微镜技术许可证。徕卡显微系统公司新成立生物系统部门，后来发展为丹纳赫集团诊断平台旗下运营公司。徕卡推出M165 C和M205 C高端体视显微镜，采用 FusionOptics 融合光学技术，树立了体视显微镜领域的新标杆。2008年大事记徕卡显微系统公司成为总部设于德国海德堡的欧洲分子生物学实验室 (EMBL) 高级培训中心的创始合作伙伴。而德国海德堡正是徕卡公司的前身之一——1872年鲁道夫荣格 (Rudolf Jung)的精密工程公司——成立的地方。徕卡推出 M720 OH5 是小巧的神经外科显微镜，配有水平光学系统，采用移动设计理念，具有出色的头顶操作性。徕卡显微系统公司凭借 FusionOptics 融合光学技术赢得 PRODEX 奖项，该技术能够形成高分辨率、更大景深、3D效果更佳的图像。徕卡 TCS SP5 X 超连续谱共聚焦显微镜荣获2008年度《科学家》杂志十大创新奖。2009年大事记2010年大事记徕卡显微系统公司在年度互联世界大会上获得 M2M 价值链金奖，Axeda Corporation 被誉为徕卡获得此奖项的一大助力。2011年大事记

2024年是徕卡显微成立第175周年。这175年，既是徕卡品牌的发展历程，也是世界光学显微技术的发展史。这175年，徕卡始终满怀热忱，以创新将可视化、分析能力推向更高更远。徕卡的愿景是瞰见未知，赋能客户，同创世界健康与美好。今天，作为丹纳赫集团旗下一员，徕卡显微正在加速科技对今日生活之影响，改善人类健康。让我们共同回顾徕卡品牌走过的百年风雨历程，感受人类在光学显微技术领域的不断开拓创新。1849 - 2004年品牌早期历程1849年德国数学家卡尔凯尔纳 (Carl Kellner) 博士在德国韦茨拉尔成立 Optical Institute 光学公司，开始镜头与显微镜的研究。 早期的徕卡显微镜工厂 1853年Optical Institute在美国成立 Bausch & Lomb 仪器部门。1865年恩斯特徕兹一世 (Ernst Leitz I) ，加入了公司并成为公司的合伙人。 恩斯特徕兹一世 (Ernst Leitz I)1869年Ernst Leitz 接管“Optical Institute”并将公司改名为“Ernst Leitz” 早期的Leitz徕兹显微镜1872年Rudolf Jung在德国的海德堡成立精密工程公司。一个世纪以后，海德堡将诞生一家培养了十多位诺贝尔奖得主的全球著名研究所——欧洲分子生物学实验室EMBL（European Molecular Biology Laboratory）。 鲁道夫荣格 (Rudolmatchf Jung)1876年 C. Reichert在奥地利的维也纳成立光学公司。 卡尔赖希特 (Carl Reichert)上述两家公司后来合并为Reichert-Jung。1881年霍勒斯达尔文 (Horace Darwin) 创立剑桥仪器光学公司 (Cambridge Instruments)，该公司也是徕卡集团的前身之一。而霍勒斯达尔文之父，正是《物种起源》的作者，进化论的奠基人，英国生物学家查尔斯达尔文 (Charles Darwin)。霍勒斯达尔文 (Horace Darwin) 查尔斯达尔文 (Charles Darwin),进化论之父1907年徕卡将第10万台量产显微镜赠予诺贝尔奖获得者罗伯特科赫 (Robert Koch)。罗伯特科赫是德国科学家，因发现结核杆菌及细菌学相关研究而获得诺贝尔医学奖，被誉为“细菌学之父”。罗伯特科赫 (Robert Koch)徕卡赠送给罗伯特科赫的显微镜罗伯特科赫在使用徕卡显微镜1913年徕卡推出首台双目筒显微镜。首台双目筒显微镜1914年奥斯卡巴纳克 (Oskar Barnack) 发明 Leitz 35 mm 小画幅相机。由此开启了相机界的顶流——Leica徕卡相机的历史。 第一台徕卡相机UR-LEICA1921年Wild Heerbrugg在瑞士创建光学公司。 海因里希怀尔德 (Heinrich Wild)1925年徕卡推出首台偏光显微镜。 1929年徕卡发布光子显微镜。1932年徕卡推出入射光荧光显微镜。 1950年代的徕卡显微镜工厂1967年 徕卡发布图像分析产品 (定量分析显微镜) 。1972年Leitz Wetzlar 和 Wild Heerbrugg 开始合作。 1976年公司拓展金属材料研究业务，并收购了达尔文创立的Cambridge Instruments（首家扫描电子显微镜制造商）。1981年Wild Leitz 集团开始规划成立。 1984年ELSAM 超声显微镜荣获德国商业创新奖。1986年Ernst Leitz 和 Wild Heerbrugg 合并成立 Wild Leitz 集团。1990年Wild Leitz、Cambridge Instruments、Reichert & Jung 和 Bausch & Lomb 合并成立徕卡集团。 1993年徕卡集团在中国设立第一家样本制备合资公司。1998年徕卡集团的徕卡相机、徕卡显微系统和徕卡测量系统三大业务单元成为三家独立公司。徕卡相机 徕卡显微系统徕卡测量系统2003年徕卡 DUV 物镜获得德国商业创新奖。2004年第一台超分辨率共聚焦 (4Pi) 显微镜。2005 - 2014年加入丹纳赫继续引领世界光学显微技术发展2005年 2005年，徕卡显微系统加入丹纳赫集团。由此，丹纳赫开始进入生命科学业务领域。 徕卡很自豪能成为丹纳赫的一员。丹纳赫是全球科学和技术的领导者。一起携手，我们正在加速科技对今日生活之影响，改善人类健康。 2005年大事记推出创新激光显微切割系统TCS SP5共聚焦显微镜面世，具备当时单台共聚焦显微镜有史以来最高的成像速度和分辨率AF6000 LX集成系统适用于高级宽场荧光成像和分析，使研究人员能够在几天内通过快速细胞动力学成像或 4D 实验来研究生命过程。徕卡 LMD6000 可处理较厚的样本和较硬的材料2006年大事记徕卡推出组织病理学网络解决方案徕卡显微系统公司第三次获得“Innovationspreis”（德国商业创新奖）2007年大事记徕卡与超高分辨率技术之父斯特凡黑尔 (Stefan Hell) ，推出超越当时显微分辨率极限的TCS STED 光学显微镜。这是世界首款商用STED显微镜，光学分辨率小于90纳米。Max Planck Innovation 签署 RESOLFT 技术的许可证协议；哈佛大学科技发展办公室向徕卡授予其 CARS 显微镜技术许可证。徕卡显微系统公司新成立生物系统部门，后来发展为丹纳赫集团诊断平台旗下运营公司。徕卡推出M165 C和M205 C高端体视显微镜，采用 FusionOptics 融合光学技术，树立了体视显微镜领域的新标杆。2008年大事记徕卡显微系统公司成为总部设于德国海德堡的欧洲分子生物学实验室 (EMBL) 高级培训中心的创始合作伙伴。而德国海德堡正是徕卡公司的前身之一——1872年鲁道夫荣格 (Rudolf Jung)的精密工程公司——成立的地方。徕卡推出 M720 OH5 是小巧的神经外科显微镜，配有水平光学系统，采用移动设计理念，具有出色的头顶操作性。徕卡显微系统公司凭借 FusionOptics 融合光学技术赢得 PRODEX 奖项，该技术能够形成高分辨率、更大景深、3D效果更佳的图像。