蛋白质溶解比率

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins。该文章的通讯作者是来自北京蛋白质组学研究中心的贾辰熙和Chen Yali研究员。生物活性肽是一类重要的生物分子，通过与蛋白受体相互作用，参与调控多种生物学进程。研究肽-蛋白相互作用对于理解这些功能分子的调节机制至关重要。目前已开发多种方法用于表征肽-蛋白的相互作用，例如通过引入荧光探针在多肽上来监测蛋白-多肽的相互作用，或者将多肽固定在磁珠或其他载体材料上进行进一步的亲和沉淀。然而以上方法都需要对多肽进行修饰，导致多肽的结构发生改变，进一步影响多肽-蛋白相互作用，产生假阳性结果。细胞热转移变分析（CETSA）和热蛋白质组分析（TPP）作为一种无修饰/无标签技术已被广泛用蛋白-配体相互作用研究。当配体与蛋白结合后，蛋白的热稳定性发生了改变，导致熔解曲线(Melting cure)发生位移。通过监测熔解温度的变化(∆Tm)，实现对蛋白-配体相互作用的检测。CETSA以及TPP允许在天然环境下研究分子互作，从而保留了内源性蛋白表达水平、翻译后修饰、局部微环境等生物物理特性。除了改变蛋白质的热稳定性，肽配体与蛋白质受体相互作用还会导致蛋白构象、疏水性和溶剂可及性的改变，一些配体甚至起到生物助溶的作用。所有这些特性的改变会导致研究体系中靶蛋白丰度的变化。这种由肽段配体结合诱导蛋白的丰度改变现象称之为PACTS。而PACTS也可以被合理的利用用于识别与肽段配体结合的靶蛋白。基于此，本文将PACTS与TPP技术相结合用于肽-蛋白质相互作用研究，PACTS可以辅助TPP分析，特别是在TPP分析过程中，由于配体-靶蛋白结合导致靶蛋白丰度降低至质谱检测限以下，无法绘制熔解曲线的情况下，PACTS可以作为另一个重要的监测手段。如图1所示，PACTS辅助TPP分析的实验流程大致如下：将蛋白提取液分成2份，分别与缓冲液（对照组）、肽配体（实验组）孵育，再将孵育后的每组样本等分成10份，在10个不同的温度下加热3 min。加热完成后，离心，收集上清液。利用SDS-PAGE将肽段与蛋白分离并进行胶内酶切。酶切后的肽段随即用TMT 10-plex标记，最后通过LC-MS/LS进行定量分析。将37 °C下对照组、实验组中同一蛋白的丰度变化作为PACTS的衡量指标（蓝框）。将在不同温度下蛋白的相对丰度变化转化为熔解曲线（黑框），实验组相较于对照组，同一蛋白熔解曲线的位移（∆Tm）作为TPP的衡量指标。综合两种方法识别出的靶标蛋白，作为最终的筛选结果。图1. PACTS辅助TPP分析的实验流程图作者首先用标准肽段-蛋白互作对验证了PACTS辅助TPP分析的可行性。如图2所示，右侧为对照组/实验组中靶蛋白在不同温度下丰度变化（Western blot），中间及左侧则是基于Western blot数据生成PACTs以及熔解曲线。对于JIP1-JNK1互作对，PACTS显示没有明显的丰度变化，而熔解曲线则显示发生了位移（图2A）。与之相反的，对于HOXB-AS3-hnRNP A1互作对，PACTS显示出明显的丰度变化，而熔解曲线则由于靶蛋白丰度降至检测限以下而无法绘制（图2B）。以上两个例子都说很好地说明，PACTS和TPP是两种互补的检测手段，使用两种方法同时检测有利用提高结果的准确性。作者还考察了不同细胞环境对蛋白-配体互作的影响（图CD及图EF）。来源于293T细胞的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= 0.5 °C（图E），而来源于Hippocampus的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= -14.4 °C（图F）。这个差异可能是由于孵育时不同的微环境造成的。图2. PACTS辅助TPP分析标准肽段-蛋白互作对。随后，作者将PACTS辅助TPP分析应用到组学层面。Aβ肽是淀粉样斑的主要成分，而淀粉样斑块主要存在于阿尔茨海默症（AD）患者的大脑中。在Aβ肽中，Aβ1-42在介导神经毒性和氧化应激中起关键作用。THP-1细胞类似于小胶质细胞，小胶质细胞功能障碍加速了与年龄相关的神经退行性疾病的进展，如AD。作者利用了PACTS辅助TPP分析研究了THP-1细胞中与Aβ1-42肽段相互作用的蛋白。如图3所示，图3A为PACTS结果，共发现37个蛋白在37 °C下有丰度变化。而TPP结果（图3B）则显示66个蛋白熔解曲线发生了位移。PACTS与TPP的结果具有较小的重合，说明两种方法具有互补性。GO分析表明（图3C），大多数与Aβ1-42相互作用的蛋白存在于细胞外泌体、胞质溶胶和细胞膜中。外泌体在AD中充当双刃剑，一方面，外泌体传播有毒的Aβ肽和过度磷酸化的tau遍及整个大脑，并诱导神经元凋亡。另一方面，它们消除大脑中的Aβ肽并促进其降解。了解Aβ肽与外泌体蛋白之间的相互作用有利于更好的开发AD治疗治疗药物。此外，作者用Western blot的方法进一步确认识别出的靶标蛋白（图D-E）。最后，作者用免疫共沉淀的方法进一步证明靶蛋白与Aβ1-42存在相互作用。图3. PACTS辅助TPP分析与Aβ1-42相互作用的蛋白总之，本文开发一种PACTS辅助TPP的分析方法，可用于大规模组学层面肽段-蛋白质相互作用研究。该方法具有无标记、无修饰的优势，无需额外实验，即可在TPP分析的同时获得PACTS信息。该方法也有助于理解多肽-蛋白质复合物相关的分子调控机制，进一步开发新型治疗药物。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins 参考文献1.Zhao T, Tian J, Wang X, et al. PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins. Anal Chem. 2022 94(18): 6809-6818. doi:10.1021/acs.analchem.2c00581

仪器信息网讯，2010年5月15日，蛋白质组数据处理暨全国生物质谱学术交流会”在云南省丽江市召开。会议为期两天，主要讨论了蛋白质组学技术和应用、数据挖掘和生物质谱等方面的现状及其进展。在所有的大会报告中，除一些关于蛋白质组学技术最新研究进展的大会特邀报告外，第一天的专家报告集中讨论了糖蛋白组的最新分析技术与研究进展，第二天的报告集中讨论了蛋白质数据处理技术，包括蛋白质组生物数据库及分析平台的构建、数据统计分析方法的研究等方面。 　　近年来蛋白质组学发展迅速，其相应的方法学研究也取得了巨大的进步，一系列新技术融入了的蛋白质组学技术当中，极大的促进了这门学科的发展。在本届大会上，中国科学院北京基因组研究所的刘斯奇研究员、复旦大学的张祥民教授、中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员等专家的报告介绍了许多应用到蛋白质组学之中的新技术、新方法，本文作简要概述： 　　报告题目：基于质谱的线粒体GST蛋白质组定性和定量分析 　　报告人：中国科学院北京基因组研究所的刘斯奇研究员 刘斯奇研究员 　　刘斯奇研究员在报告中首次提出了“线粒体GSTs蛋白质组”的概念，系统地研究了属肝线粒体中的GSTs。可采用亲和色谱法及SDS-PAGE富集GST蛋白，使用MALDI Tof/Tof MS 和LC tandem MS/MS鉴别蛋白。研究结果表明，属肝线粒体中存在5种GSTs，分别为GSTA3, GSTM1, GSTP1, GSTK1 以及GSTZ1。 　　为了对线粒体GSTs的相对丰度进行定量分析，其采用了质谱结合免疫印迹的综合分析方法：利用质谱对GSTs进行定性分析时，根据质谱谱图的多反应监测(MRM)推断GSTs结构 使用重组的GST蛋白作为标准物，建立了蛋白浓缩物的线性回归方程和胰蛋白酶GST多肽的MS/MS强度，同时，通过校准估算出了鼠肝线粒体中的GSTs含量。通过对特定GSTs抗体的强度识别，使用免疫印迹对GSTs进行了定量分析 获得了GST重组蛋白的5种单克隆抗体，将其用于GST浓度校准和免疫印迹强度分析 通过免疫印迹分析获得的定性分析结果基本与MRM数据获得的结果一致。 　　报告题目：蛋白质水平的色谱分离与生物质谱鉴定新方法研究 　　报告人：复旦大学张祥民教授 张祥民教授 　　张祥民教授在报告中表示，蛋白质的分离鉴定有更多困难。一方面，蛋白质分子量大，结构与构型上的变化导致分离效率下降，对色谱填料的孔径、分布与非特异性吸附等因素有更高要求 另一方面，蛋白质鉴定需要先进行酶解以得到质谱鉴定信息。 　　在报告中，他给出了较好的解决方法，通过对液相色谱分离系统的优化，在实际蛋白质样品考察优化了系统的分离性能，构建了液相色谱分离蛋白质鉴定方法与平台。研制了蛋白水平富集预柱，并将其应用于蛋白质捕集。在离子交换色谱柱和反向色谱优化选择上，实现了蛋白质分析所需的高分辨分离。色谱分离组分点样至靶板上，利用发展的快速酶解技术完成蛋白质酶解，再通过MALDI-TOFTOFMS或LC-LTQMS进行蛋白质鉴定。该方法使得蛋白质的理论分离能力达到5000个以上，蛋白质组分能够得到浓度信息，质谱鉴定可以同时利用肽指纹图谱PMFs信息和串级序列信息，使得蛋白质鉴定的可靠性大为提高。 　　报告题目：基于离子液体的新型膜蛋白质组预处理及分离鉴定技术 　　报告人：中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员 张丽华研究员 　　膜蛋白质存在于细胞内环境、细胞与细胞外环境的界面，对执行细胞内外物质交换、信息转换、细胞识别、代谢调节、免疫应答等功能起着重要作用。深入开展膜蛋白质组学研究对于揭示细胞功能、寻找药物靶点以及研制癌症治疗药物等具有重要意义。然而，由于膜蛋白质具有疏水性强、溶解性差、易沉淀、难酶解、含量低等特点，因此在采用通常用于可溶性蛋白质组分离鉴定的方法对膜蛋白质组进行研究时遇到了很大的挑战。 　　张丽华研究员在报告中指出，要提高膜蛋白质组的分析能力，必须发展可显著改善膜蛋白质组溶解性，又不影响后续分离鉴定的新方法。她在近期研究工作中，采用离子液体作为膜蛋白质组的增溶剂，并结合纳升二维液相色谱-质谱联用系统，对鼠脑和人肝内质网提取的膜蛋白质进行了分析。结果表明，离子液体不仅可以提高膜蛋白的溶解性，而且不用影响后续酶解过程中酶的活性。此外，在样品进入质谱鉴定前，易于在除盐步骤去除，不会影响质谱鉴定。与其他膜蛋白质组研究中常用的增溶剂相比，离子液体在膜蛋白质组样品预处理中表现出明显的优势。

蛋白质印迹实验具体操作步骤 蛋白质印迹免疫分析的过程包括蛋白质经凝胶电泳分离后，在电场作用下将凝胶上的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白质的抗体 作为探针与之结合，经洗涤后，再将滤膜与二级试剂-放射性标记的或辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶 偶联抗免疫球蛋白抗体 结合，进一步洗涤后，通过放射自显影或原位酶反应来确定抗原-抗体-抗抗体复合物在滤膜上的位置和丰度。 【蛋白质印迹实验所需试剂】 1.IgG 标准品 2.羊抗人辣根过氧化物酶（HRP）标记的IgG 抗体 3.转移buffer:Tris 3.03g,Gly14.4g,甲醇200ml,加三蒸水至 1000ml充分溶解，4℃冰箱贮存。 4.Tris buffer（TBS）：Tris 2.42g,NaCl 29.2g,溶于600ml三蒸水，再用1N HCl调至pH7.5,然后补加三蒸水至1000ml. 5.漂洗液（TTBS）：TBS液500ml,加 Tween20 250ul. 6.封闭液：5%脱脂奶粉。 7.抗体buffer:1.5g BSA溶于50ml TTBS. 8.显色液DAB（3.3-diaminobenzidine,3.3-二氨基联苯胺）配制：5mg DAB溶于10ml 柠檬酸buffer（0.01mol/L 柠檬酸2.6ml,0.02 mol/L Na2HPO4 17.39ml），加30% H2O2 10 &mu l（临用时现配）。 9.脱色液：甲醇250ml,冰醋酸100ml,加蒸馏 水至1000ml. 10.氨基黑染色液（0.1%氨基黑 -10B）：0.2g 氨基黑-10B 溶于200ml 脱色液中，充分搅拌溶解，滤纸 过滤。 【蛋白质印迹实验操作步骤】 一、样品的SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 按实验四操作步骤进行。加样时，注意在同一块胶上按顺序做一份重复点样，以备电泳结束时，一份用于免疫鉴定，一份用于蛋白染色显带，以利相互对比，分析实验结果。 二、转移印迹 1.转移前准备：将滤纸，硝酸纤维素膜（NC）剪成与胶同样大小，NC膜浸入蒸馏 水中 10-20min 后浸入转移buffer中平衡30min . 2.凝胶平衡：将电泳后的SDS -PAGE胶板置于转移buffer 中平衡 30-60min. 3.按图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。 4.开始转移，连接正负极，盖好盖子，接上电源，恒流 0.8mA/cm,室温下转移1h,转移后的凝胶再用氨基黑10B染色液染色20min ,然后脱色检测转移效果。 三、免疫染色 1.转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。 2.TBS洗膜1-2次，10min/次。 3.加HRP标记的抗体，室温1h . 4.TBS 洗3次，10min/次。 5.NC膜再转入DAB显色液中，置暗处反应，待显色反应达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应。