蛋白质结构

几种不同折叠模式的蛋白质模型(图片来源Protein Data Bank Japan ) 　　上个世纪初，科学家们认为蛋白质是生命体的遗传物质，而具有独特的作用。随着这个理论被证伪，真正的遗传物质DNA的结构被给予了很大关注。然而，蛋白质作为生命体的重要大分子，其重要性也从未被忽视，而且在1950年代开始，科学家一直在探寻DNA序列和蛋白质序列的相关性。与此同时，蛋白质测序和结构解析蛋白质结构的努力开始慢慢获得回报。更多的生化研究揭示了蛋白质的功能重要性，因此蛋白质的三维结构的解析对于深入理解蛋白质功能和生理现象起着决定性作用。 　　本文简要回顾了蛋白质结构解析的重大历史事件，并总结了蛋白质结构解析的常用方法和结构分析方向。通过了解蛋白质结构，能够让我们更好地理解生物体的蛋白的理化特性，以及其相关联的化学反应途径及其机制，对于我们认识生物世界和研发治疗方法和药物都起着关键作用。在即将召开的2015高分辨率成像与生物医学应用研讨会上，各位专家学者将会进一步讨论相关议题。 　　蛋白质结构解析六十年来大事件 　　在1958年，英国科学家John Kendrew和Max Perutz首先发表了用X射线衍射得到的高分辨率的肌红蛋白Myoglobin的三维结构，然后是更加复杂的血红蛋白Hemoglobin。因此，这两个科学家分享了1962年的诺贝尔化学奖。事实上，这项工作在早在1937年就开始了。 　　然后在1960年代，蛋白质结构解析方法不断进步，获得了更高的解析精度。这个时期，蛋白质序列和DNA序列间关系也被发现，中心法则被Francis Crick提出，然后科学界见证了分子生物学的崛起。分子生物学(Molecular Biology)的名称在1962年开始被广泛接受和使用，并逐渐演变出一些支派，如结构生物学。然后在1964年，Aaron Klug提出了一种基于X射线衍射原理发展而来的全新的方法电子晶体学显微镜(crystallographic electron microscopy )，可以解析更大蛋白质或者蛋白质核酸复合体结构。因为这项研究，他获得了1982诺贝尔化学奖。1969年，Benno P. Schoenborn 提出可以用中子散射和原子核散射来确定大分子中固定位置的氢原子坐标。 　　进入1970年代，很多新的方法开始发展。存储蛋白质三维结构的Protein Data Bank(1971年) 开始出现，这对于规范化和积累蛋白质数据有着重要意义。1975年新的一种仪器叫做多丝区域检测器，让X-ray的检测和数据收集更加快速高效。次年，Robert Langride将X-ray衍射数据可视化，并在加州大学圣地亚哥分校成立了一个计算机图形实验室。同年，KeithHodgson和同事首次证明了可以使用同步加速器获得的X射线并对单个晶体进行照射，并取得了很好的实验效果。然后在1978年，核磁共振NMR首次被用于蛋白质结构的解析 同年首个高精度病毒(西红柿丛矮病毒)衣壳蛋白结构被解析。 　　在1980年代，更多蛋白质结构被解析，蛋白质三维结构的描述越来越成熟，而且蛋白质结构解析也被公认成为药物研发的关键步骤。在1983年，冷冻蚀刻的烟草花叶病毒结构在电子显微镜结构下得到描述。两年后德国科学家John Deisenhofer等解析出了细菌光合反应中心，因此他们共享了1988年的诺贝尔化学奖。次年，两个课题组解析了HIV与复制相关的蛋白酶结构，对针对HIV的药物研发提供了理论基础。 　　下一个十年，因为大量同步加速器辅助的X射线衍射的使用，数千个蛋白质结构得到解析，迎来了蛋白质结构组的曙光。1990年多波长反常散射方法(MAD)方法用于X射线衍射晶体成像，与同步辐射加速器一起，成为了近二十多年来的最常用的的方法。Rod MacKinnon在199年发表了第一个高精度的钾离子通道蛋白结构，对加深神经科学的理解起了重要作用，因此他分享了2003年的诺贝尔化学奖。Ada Yonath等领导的课题组在1999年首次解析了核糖体结构(一种巨大的RNA蛋白质复合体)。　　进入新千年，更多的技术细节被加入到蛋白质解析研究领域。2001年，Roger Kornberg和同事们描述了第一个高精度的RNA聚合酶三维结构，正因此五年后他们共享了诺贝尔化学奖。2007年，首个G蛋白偶联受体结构的解析更是对药物研究带了新的希望。近些年来，越来越多的大的蛋白质结构得到解析。Cryo-EM超低温电子显微镜成像用于超大蛋白质结构成像的研究日益成熟，并开始广泛用于蛋白质结构的解析。 　　蛋白质结构解析的常用实验方法 　　1.X-ray衍射晶体学成像 　　X射线衍射晶体学是最早用于结构解析的实验方法之一。X射线是一种高能短波长的电磁波(本质上属于光子束)，被德国科学家伦琴发现，故又被称为伦琴射线。理论和实验都证明了，当X射线打击在分子晶体颗粒上的时候，X射线会发生衍射效应，通过探测器收集这些衍射信号，可以了解晶体中电子密度的分布，再据此析获得粒子的位置信息。利用这种特点，布拉格父子研制出了X射线分光计并测定了一些盐晶体的结构和金刚石结构。首个DNA结构的解析便是利用X射线衍射晶体学获得的。 　　后来，获得X射线来源的技术得到了改进，如今更多地使用同步辐射的X射线源。来自同步辐射的X射线源可以调节射线的波长和很高的亮度，结合多波长反常散射技术，可以获得更高精度的晶体结构数据，也成为了当今主流的X射线晶体成像学方法。由X射线衍射晶体学解析的结构在RCSB Protein Data Bank中占到了88%。 　　X射线衍射成像虽然得到了长足的发展，仍然有着一定的缺点。X射线对晶体样本有着很大的损伤，因此常用低温液氮环境来保护生物大分子晶体，但是这种情况下的晶体周围环境非常恶劣，可能会对晶体产生不良影响。而且，X射线衍射方法不能用来解析较大的蛋白质。 　　上海同步辐射加速器外景(图片来源 上海同步辐射光源网站) 　　2.NMR核磁共振成像 　　核磁共振成像NMR全称Nuclear magnetic resonance，最早在1938被Isidor Rabi (1946年诺贝尔奖)描述，在上世纪的后半叶得到了长足发展。其基本理论是，带有孤对电子的原子核(自选量子数为1)在外界磁场影响下，会导致原子核的能级发生塞曼分裂，吸收并释放电磁辐射，即产生共振频谱。这种共振电磁辐射的频率与所处磁场强度成一定比例。利用这种特性，通过分析特定原子释放的电磁辐射结合外加磁场分别，可以用于生物大分子的成像或者其他领域的成像。有些时候，NMR也可以结合其他的实验方法，比如液相色谱或者质谱等。 　　RCSB Protein Data Bank数据库中存在大约11000个用NMR解析的生物大分子结构，占到总数大约10%的结构。NMR结构解析多是在溶液状态下的蛋白质结构，一般认为比起晶体结构能够描述生物大分子在细胞内真实结构。而且，NMR结构解析能够获得氢原子的结构位置。然而，NMR也并非万能，有时候也会因为蛋白质在溶液中结构不稳定能难得获取稳定的信号，因此，往往借助计算机建模或者其他方法完善结构解析流程。 　　使用NMR解析的血红蛋白结构建模(图片来源RCSB PDB) 　　3.Cryo-EM超低温电子显微镜成像 　　电子显微镜最早出现在1931年，从设计之初就是为了试图获得高分辨率的病毒图像。通过电子束打击样本获得电子的反射而获取样本的图像。而图像的分辨率与电子束的速度和入射角度相关。通过加速的电子束照射特殊处理过的样品表明，电子束反射，并被探测器接收，并成像从而获得图像信息。具体做法是，将样品迅速至于超低温(液氮环境)下并固定在很薄的乙烷(或者水中)，并置于样品池，在电子显微镜下成像。图像获得后，通过分析图像中数量众多的同一种蛋白质在不同角度的形状，进行多次的计算机建模从而可以获得近原子级别的精度(最低可以到2.0埃)。 　　Cyro-EM解析TRPV1离子通道蛋白(图片来源Structure of the TRPV1 ion channel ) 　　将电子显微镜和计算机建模成像结合在一起的大量实践还是在新世纪之后开始流行的。随着捕捉电子的探测器技术(CCD技术，以及后来的高精度电子捕捉、电子计数electron counting设备)的提升，更多的信息和更低的噪音保证了高分辨率的图像。 　　近些年来，Cryo-EM被用来解析很多结构非常大(无法用X-ray解析)的蛋白质(或者蛋白质复合体)，取得了非常好的结果。同时，单电子捕捉技术取代之前的光电转换成像的CCD摄像设备，减少了图像中的噪音和信号衰减，同时并增强了信号。计算机成像技术的成熟和进步，也赋予了Cryo-EM更多的进步空间。然而，Cyro-EM与X-ray不同，该方法不需要蛋白质成为晶体，相同的是都需要低温环境来减少粒子束对样品的损害。 　　除去介绍的这三种方法以外，计算机建模技术也越来越多地被用在了蛋白质结构解析中。而且新解析的结构也会提高计算机建模的精确度。未来，我们或许能够用计算机构建原子级别的细胞模型，构建在芯片上的细胞。 　　蛋白质结构对了解生命体的生化反应、有针对性的药物研发有着重要意义。从1958到如今已经接近60年，蛋白质结构解析得到了较快的发展。然而，在如今DNA测序如此高效廉价的时代，蛋白质和DNA结构解析并没有进入真正高速发展阶段，这也导致了在如此多的DNA序列数据非常的今天，结构数据却相对少的可怜。大数据时代的基因组、蛋白质组、代谢组、脂类组等飞速发展的时候，蛋白质结构组也得到了更加广泛的重视。发展高精度、高效的结构解析技术也一直都有着重要意义。未来，蛋白质结构解析，对针对蛋白质的药物筛选，和计算机辅助的药物研究研究不应被低估。未来说不定在蛋白质结构领域有着更多惊喜，让我们拭目以待。 第一届电镜网络会议部分视频回放

《自然-方法学》：蛋白质结构分析新技术创测定速度纪录 　　过去需几年时间完成的工作现在仅用几天即可完成 　　据美国物理学家组织网7月20日报道，隶属于美国能源部的劳伦斯伯克利国家实验室的科学家开发出一种利用小角度X射线散射技术测定蛋白质结构的新方法，大大提高了蛋白质结构研究分析的效率，使过去需要几年时间完成的工作仅需要几天即可完成，这将极大地促进结构基因组学的研究进程。 　　结构基因组学是一门研究生物中所有蛋白质结构的科学。通过对蛋白质结构的分析，可大致了解蛋白质的功能。结构基因组学重视快速、大量的蛋白质结构测定，而快速结构测定技术正是该学科研究面临的一个瓶颈问题。目前通常使用的两种测定技术，X射线晶体衍射和核磁共振质谱技术，虽然精确，但速度很慢，测定一个基因的蛋白质结构，动辄就需要几年的时间。随着新发现的蛋白质及蛋白质复合物越来越多，目前的分析速度远远不能满足研究的需要。 　　为解决这个瓶颈问题，劳伦斯伯克利国家实验室的科学家们借助了该实验室的先进光源(ALS)。他们运用一种称为小角度X射线散射(SAXS)的技术，对处于自然状态下(如在溶液之中)的蛋白质进行成像，其分辨率大约为10埃米(1埃米等于1/10纳米)，足够用来测定蛋白质的三维结构。ASL产生的强光可以使实验所需材料减至最少，这使得该技术可以用于几乎所有生物分子的研究。 　　为了最大限度提高测定速度，研究小组安装了一个自动装置，可自动使用移液器吸取蛋白质样品到指定位置，以便利用X射线散射进行分析研究。他们还使用美国能源部国家能源研究科学计算机中心(NERSC)的超级计算资源进行数据分析。利用这一系统，研究小组取得了惊人的研究效率，在1个月内分析测定了火球菌的40组蛋白质结构。如果使用X射线晶体衍射技术，这可能需要花几年时间。同时，他们所获取的信息十分全面，涵盖了溶液中大部分蛋白质样本的结构信息。相比于在结构基因组学启动计划中使用核磁共振和晶体衍射技术仅能获取15%的信息量来说，这是十分巨大的进步。 　　高通量蛋白质结构分析有助于加快生物燃料的研究步伐，帮助解读极端微生物在恶劣环境中的繁荣之谜，更好地理解蛋白质的功能。研究小组之所以首先选择火球菌进行实验分析，就是因为它可用来生产清洁能源——氢。同时，在许多工业流程中都会出现高酸高热的环境状态，而这正是火球菌喜欢的生存环境。 　　但这种技术也有不足之处，追求速度会造成一种失衡，使成像质量相应打了折扣。与X射线晶体衍射成像的超高分辨率相比，小角度X射线散射成像的分辨率比较低，大约是10埃米。但这并不妨碍该技术的应用前景，因为并不是所有的研究都需要超高精度成像。对于结构基因组学研究来说，有时只要知道一种蛋白质与另一种蛋白质具有相似的结构，就可以了解其功能。而且，小角度X射线散射技术能够提供溶液中蛋白质形状、结构及构造变化等方面的精确信息，足以弥补其在成像精度方面的不足。 　　该研究成果刊登在7月20日《自然—方法学》杂志网络版上，美国斯克利普斯研究所和乔治亚州大学的科学家亦参与了该项研究。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Nat. Struct.上的文章，Towards a structurally resolved human protein interaction network，该文章的通讯作者是瑞典斯德哥尔摩大学的Petras Kundrotas、Arne Elofsson和欧洲分子生物学实验室的Pedro Beltrao。蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的表征对于理解形成功能单位的蛋白质组和细胞生物学研究的基础是至关重要的。同时，蛋白质复合物的结构表征是理解蛋白质的功能机制、研究突变的影响和研究细胞调控过程的关键步骤。最近，基于神经网络的方法已经被证明了准确预测单个蛋白质和蛋白质复合物的结构的能力；然而，其在大规模预测人类复杂结构中的应用尚未得到有效测试。在此，本文测试了应用AlphaFold2在预测人类蛋白质相互作用结构上的潜力和局限性，并通过实验提示了界面残基中潜在的调节机制。除此之外，本文还提供了使用预测的二元复合物来构建高阶组装的案例，以此拓展了对于人类细胞生物学的理解。人类蛋白质相互作用的结构预测本文基于AlphaFold2的FoldDock管道对65484对来源于HuRI与hu.MAP V.2.0数据库中实验测定的PPIs的结构进行预测。文章合并了一个pDockQ分数，该分数可以根据置信度对模型进行排序。结果显示，已知相互作用蛋白的pDockQ往往高于随机集；对于hu.MAP数据集显示出平均比HuRI数据集更高的可信度，这表明，高可信度模型集中在具有高亲和力和直接相互作用的蛋白质相互作用区域。实验表明，AlphaFold2可以预测大型复合物中直接相互作用的蛋白对的结构（图1）。图1 | AlphaFold2复合物预测在大规模人类PPIs数据集上的应用影响预测置信度的特征如图1a所示，相较于HuRI和hu. MAP数据库中的蛋白质对，出现在蛋白质数据库（PDB）中的蛋白质对更加富集于高分模型部分。为了更好地理解这种差异，本文首先研究了一个由大型（10链）异质蛋白复合物构建的额外数据集。通过实验，结果显示直接相互作用对与间接相互作用对之间pDockQ分数的差异是显著的，这表明与间接相互作用对相比，即使直接相互作用对是大型复合体的一部分，也往往能够被预测。除此之外，由于HuRI数据库中的许多蛋白质间相互作用很可能是短暂的，而AlphaFold2无法可靠地预测这种相互作用（图2）。图2 | 影响预测置信度的蛋白质和相互作用特征：不同数据集的分析预测的复合物结构在化学交联上的验证化学交联结合质谱分析是一种识别蛋白质对中邻近的活性残基的方法，可以用来帮助确定可能的蛋白质界面。为了确定预测的复合物结构是否满足这种正交空间约束，本文获取了528对具有预测模型的蛋白质对的残基对的交联集合。在此章节中，文章提供了多个案例证明了化学交联验证的有效性（图3）。图3 | 对于预测复合物模型的化学交联支持复合物界面上与疾病相关的错义突变与人类疾病相关的错义突变可以通过多种机制改变蛋白质的功能，包括破坏蛋白质的稳定性、变构调节酶活性和改变PPIs。为了确定预测结构的有效性，本文汇编了一组位于界面残基上的突变，这些突变之前曾被实验测试过对于相应相互作用的影响。文章使用FoldX预测突变时结合亲和力的变化，并观察到破坏相互作用的突变强烈影响了结合的稳定性；另外，本文就在一系列生物学功能中具有界面疾病突变的蛋白质网络簇进行了举例说明（图4）。图4 | 蛋白质复合物界面残基的疾病突变蛋白质复合物界面的磷酸化调节蛋白质磷酸化可以通过改变修饰残基的大小和电荷来调节结合亲和力来调节蛋白质的相互作用，将磷酸化位点定位到蛋白质界面可以为它们在控制蛋白质相互作用中的功能作用产生机制假说。本文使用了最近对人类磷酸化蛋白质组26的鉴定，在高置信度模型中鉴定出了界面残基上的4,145个独特的磷酸化位点。实验表明，某些界面可能受到特定激酶和条件的协调调控。虽然不是所有界面上的磷酸位点都可能调节结合亲和力，但这一分析为特定扰动后的相互作用的潜在协调调控提供了假设（图5）。图5 | 界面残基上磷酸化位点的协同调控来自二元蛋白质相互作用的高阶组装蛋白质既能够同时与多个伙伴相互作用组成更大的蛋白复合物，又能够在时间和空间上分离。这也反映在文章的结构特征网络中，即蛋白质可以在群体中被发现，如蛋白质相互作用全局网络视图所示（图6）。由于使用AlphaFold2预测更大的复合物组装可能受到计算需求的限制，文章测试了蛋白质对的结构是否可以迭代结构上对齐。文章在上述网络中覆盖的一组小的复合物上测试了这一过程，并将一个实验确定的结构与预测的模型进行对齐，展示了该过程的潜力和局限性。受测试例子的鼓励，本文定义了一个自动化过程，通过迭代对齐生成更大的模型。总之，文章发现可以迭代地对齐相互作用的蛋白质对的结构来构建更大的组装，但同时也发现了目前限制这一过程的问题。图6 | 对高阶组装的蛋白质复合物的预测结论本文通过一系列的实验评估了应用AlphaFold2预测已知人类PPIs的复杂结构的潜力与局限性。分析结果表明，由亲和纯化、共分馏和互补的方法组合支撑的蛋白质相互作用能够产生更高置信度的模型。文章证明，可以使用模型指标（如pDockQ评分）对高置信度模型进行排序，为大规模PPIs和稳定复合物的详细研究提供支持；而来自交联质谱实验的数据为进一步验证这些预测提供了理想的资源。除此之外，本文用疾病突变和磷酸化数据证明了蛋白质界面的结构模型对于理解分子机制以及突变和翻译后修饰的影响至关重要；最后，文章提出了从预测的二元配合物出发构建更大的组件结构模型的想法。后续仍需要更多的工作来确定确切的化学计量学，设计方法和评分系统来构建如此更大的复杂组件，以及预测具有弱和瞬态相互作用的蛋白质之间的相互作用。参考文献(1) Burke DF, Bryant P, Barrio-Hernandez I, et al. Towards a structurally resolved human protein interaction network [published online ahead of print, 2023 Jan 23]. Nat Struct Mol Biol. 2023 10.1038/s41594-022-00910-8. doi:10.1038/s41594-022-00910-8