色谱体外分析方法

目的 使用ACQUITY UPLC® ／Xevo&trade G2 QTof质谱系统及MetaboLynx&trade XS应用管理软件，鉴定通过人肝微粒体体外孵育而获取的1 &mu M维拉帕米的代谢物。 背景 近年来，随着越来越多的一线药品因存在安全性顾虑而退出市场，人们对药品研发过程中的药物代谢和毒性研究给予了更多的关注。如今，在药物发现和研制阶段提早进行药物代谢研究的趋势已比较明显。普遍的做法是对母体药物进行体外代谢物研究，以便在药品开发早期迅速确定其弱点。 在药物发现阶段进行代谢物鉴定的一项挑战是：需要提供快速而通用的方法，并且该方法应足够灵敏，以使体外孵育研究可在低&mu M浓度水平下进行，从而使其更接近于化合物的体内作用情况。 一项典型的体外代谢研究还包括分析母体药物的代谢速率和途径。此类研究的理想分析方案需提供在模拟体内条件的底物浓度下对代谢物进行检测的分析速度和灵敏度。 利用与UPLC/MSE联用的Xevo G2 QTof质谱系统，体外代谢物研究可在低&mu M水平下进行，同时具有较好的速度、灵敏度和选择性。 图1. 人肝微粒体维拉帕米（1 &mu M）的孵育结果显示在MetaboLynx浏览器 中。 解决方案 将浓度为1 &mu M的维拉帕米与人肝微粒体在37° C下进行孵育，并分别在 0、15、30、60、120和 240分钟时加入等体积的冷乙腈终止反应。对样品进行离心，并取上清液直接进样。 【 技 术 概 要 】 采用沃特世ACQUITY UPLC® 系统，ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（1.7 &mu m、2.1 x 100 mm），进行色谱分离。流动相由0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）组成，进样量为5.0 &mu L。在ESI正离子模式下，使用Xevo G2 QTof质谱仪采用UPLC/MSE技术进行数据采集，这样一次进样即可同时获取母离子和产物离子的数据。 MetaboLynx XS应用管理软件用于进行数据挖掘，结果显示在MetaboLynx浏览器中（如图1所示）。产物离子信息同时进行处理，并显示在MetaboLynx浏览器中的碎片分析窗口内（图2）。通过对多个孵育时间点的样品进样分析，母体药物的清除曲线和代谢物的形成曲线可在同一次试验中同时获取（如图3所示）。 总结 这个应用表明：通过使用配备UPLC/MSE 和MetaboLynx XS工作流程的Xevo G2 QTof质谱系统，体外代谢物研究可在低浓度（&mu M）水平下进行，同时具有较好的速度、灵敏度和选择性。 Xevo G2 QTof系统及其创新型QuanTof&trade 和Engineered Simplicity&trade 技术，与ACQUITY UPLC系统实现了完美结合。它是目前最灵敏的台式oaTOF仪器，拥有1 ppm的准确质量测定能力，数据采集速度高达每秒20张光谱图。 通过采用UPLC/MSE 数据采集策略，再加上具有化学智能的MetaboLynx XS数据处理工作流程，只需进行一次液相色谱进样即可快速完成所有代谢物的鉴定工作。通过在多个时间点进样，可比较容易地获取低浓度（&mu M）孵育水平下目标药物的代谢速率和途径。因此，产能最大化的目标即可轻松实现。

盐酸氨溴索（Ambroxol Hydrochloride）于20世纪80年代在德国上市，后在法国、日本等国家陆续上市，是目前临床作用较强的祛痰药。其作用机理为增加呼吸道黏膜浆液腺的分泌，减少粘液腺分泌，促进肺表面活性物质分泌，增加支气管纤毛运动，使痰液易于咳出。盐酸氨溴索片为固体制剂，其体外溶出度的考察不仅是评价产品质量的一个重要指标，还是我国食品药品监督管理局规定的仿制药一致性评价中需要与原研药对比的一个重要指标。盐酸氨溴索的结构式 本研究根据国食药监注[2013]34号文《国家食品药品监督管理局关于开展仿制药质量一致性评价工作的通知》要求制定的仿制药质量一致性评价—盐酸氨溴索片一致性评价参比制剂/溶出曲线测定（草案）制定实验方案。使用岛津SNTR-8400溶出度仪和LC-30A超高效液相色谱系统开展盐酸氨溴索片体外溶出的研究。盐酸氨溴索片经溶出实验，用超高效液相色谱 LC-30A系统进行含量测定。在四种介质中分别对两组33μg/mL 浓度的盐酸氨溴索对照品连续测定3次作为对照，结果显示使用岛津SNTR-8400溶出度仪以及岛津LC-30A超高效液相色谱系统在测定盐酸氨溴索片体外溶出曲线时具有良好适应性和重复性，能够满足国家规定药物体外溶出曲线测定的相关要求。岛津SNTR-8400溶出度仪 了解详情，敬请点击《盐酸氨溴索片在4种溶出介质中的体外溶出研究》关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。 更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn/an/。 岛津官方微博地址http://weibo.com/chinashimadzu。岛津微信平台

结直肠癌是最多发的癌症之一，病死率高居全球第二。目前，利用患者肿瘤组织构建的类器官模型已成为研究肿瘤发生分子机制的常用研究手段。多种肿瘤类器官已被成功构建，包括结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌等。然而，这些研究大部分仅在大量细胞系综平均的水平评估了患者组织衍生的类器官的各种分子特征，如基因突变、基因组拷贝数变异以及基因表达等变化，并未在单细胞水平进行评估，从而无法系统地评估构建的类器官个体内部的肿瘤细胞异质性情况，特别是由于构建类器官的成功率常常不是很高，同时得到同一个患者的体内肿瘤单细胞组学数据以及在体外建成类器官后的配对单细胞组学数据非常困难。为了系统地评估结直肠癌类器官培养系统，解析类器官与对应的体内肿瘤上皮细胞之间的异同以及不同培养体系对类器官基因表达特征的影响，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）汤富酬教授团队与北京大学第三医院普通外科付卫教授团队合作，对来自6名结直肠癌患者的体内肿瘤组织和癌旁正常组织，以及对它们进行体外培养建立的相应的类器官进行了高精度单细胞转录组测序，并结合全基因组甲基化测序、全基因组测序、全外显子组测序以及靶位点Sanger测序等，对两种常见结直肠类器官培养体系从转录组、基因组和DNA甲基化组三个层面进行了系统的比较和评估（图1）。该研究成果于2022年4月28日以“Systematic evaluation of colorectal cancer organoid system by single-cell RNA-Seq analysis”为题在线发表在 Genome Biology 上。图1 实验设计方案示意图该研究有以下3个主要发现：1、肿瘤组织来源的类器官能准确反映对应体内肿瘤上皮细胞（癌细胞）在基因表达、基因突变以及DNA甲基化等方面的关键特征。通过探索体内肿瘤特异性基因表达模式，该研究发现肿瘤来源的类器官高表达体内肿瘤上皮细胞（癌细胞）特异性表达的基因。并且，肿瘤组织来源的类器官也维持了体内肿瘤上皮细胞特异性的基因调控网络特征。另外，通过对全基因组（WGS）、全外显子组（WES）以及DNA甲基化组（PBAT）数据进行分析，该研究发现肿瘤类器官能非常好地维持体内肿瘤上皮细胞（癌细胞）在基因突变和DNA甲基化等方面的关键特征（图2）。这表明现有培养体系中的结直肠癌肿瘤类器官非常好地维持了对应患者体内癌细胞的关键生物学特征，因而使用肿瘤类器官筛选的癌症治疗候选药物应该对对应患者体内的癌细胞也会有类似的杀伤效果。现有的肿瘤类器官是肿瘤杀伤药物筛选的优秀平台。图2 体内外肿瘤细胞和正常肠上皮细胞的基因组拷贝数变异、DNA甲基化以及基因突变的比较2、癌旁正常组织来源的类器官在转录组水平上表现出部分肿瘤样特征，但保持正常的基因组和全局DNA甲基化组特征。首先该研究鉴定了体内肿瘤上皮细胞和癌旁正常肠上皮细胞的差异表达基因，并研究了这些差异基因在体外肿瘤类器官和正常肠上皮类器官的表达情况。结果显示，体外正常肠上皮类器官和肿瘤类器官均高表达体内肿瘤上皮细胞特异性表达的基因。为了进一步验证此结果，该研究对体内组织和体外类器官进行了肿瘤特异性表达基因CEACAM6的免疫荧光染色。与单细胞转录组数据一致，CEACAM6仅在体内肿瘤上皮细胞中高表达，而在体内癌旁正常肠上皮细胞中则不表达。然而，体外培养的肿瘤类器官和正常肠上皮类器官均高表达CEACAM6蛋白，此结果与单细胞转录组测序结果一致（图3）。该研究的癌旁正常组织都取自距离肿瘤组织边缘至少10厘米以外的区域，其正常组织内部混杂大量肿瘤细胞的可能性非常低，但为了进一步排除正常组织类器官有可能是混杂在癌旁正常组织中的肿瘤细胞体外扩增而导致这一现象，该研究进一步探究了体外肿瘤类器官和正常肠上皮类器官的基因突变和基因组拷贝数变异情况。结果显示只有肿瘤类器官呈现与对应患者体内肿瘤细胞相似的基因组拷贝数变异和基因突变，而正常肠上皮类器官的基因组与体内正常肠上皮细胞一致，没有肿瘤细胞特异性的基因突变和基因组拷贝数变异，从而排除了正常组织类器官起源于癌旁正常组织中混杂部分肿瘤上皮细胞的可能性。这些数据显示，在转录组和蛋白水平上，肿瘤上皮类器官和正常肠上皮类器官都表现出肿瘤样特征。这表明现有的培养体系使得正常肠上皮类器官也具有部分肿瘤细胞特征，因而用同一个患者得到的肿瘤类器官和癌旁正常肠上皮类器官进行配对药物筛选以筛选出特异性对肿瘤细胞有选择性杀伤效果（杀伤肿瘤类器官，但是不杀伤正常肠上皮类器官）的候选药物目前是无法实现的。图3 CEACAM6免疫染色荧光结果3、条件培养基在肿瘤类器官的长期培养方面优于化学成分确定培养基（分子培养基）。首先，该研究通过MKI67的表达情况对不同培养基中的细胞增殖情况进行了评估（图4）。在化学成分确定培养基（分子培养基）中，正常组织来源的类器官相比肿瘤来源的类器官具有更快的细胞增殖速度。而在条件培养基中，正常组织来源的类器官和肿瘤来源的类器官的细胞增殖速度相当。这说明化学成分确定培养基（分子培养基）更有利于正常肠上皮细胞的生长，而条件培养基对正常肠上皮细胞和肿瘤上皮细胞（癌细胞）的生长没有明显偏好性。而这一特点通过线粒体突变在不同培养基中培养的癌细胞的谱系追踪得到了进一步验证。图4 体内组织以及体外两种培养基中的类器官细胞表达MKI67的比例此外，该研究结果表明，条件培养基比化学成分确定培养基（分子培养基）更能真实地反映对应体内肿瘤上皮细胞（癌细胞）与正常肠上皮细胞的差异。与体内相应的癌细胞相似，在条件培养基中培养的肿瘤类器官呈现肠上皮干祖细胞标志基因OLFM4高表达和肠上皮分化成熟标志基因CA2低表达的特征，正常组织类器官呈现相反的OLFM4低表达和CA2高表达的模式（图5）。然而，在化学成分确定培养基（分子培养基）中，无论是正常组织类器官还是肿瘤类器官都具有相似的OLFM4高表达和CA2低表达的模式，无法准确模拟对应体内不同类型上皮细胞基因表达的不同特征。这表明现有的两种培养体系对维持对应体内肿瘤细胞关键生物学特征都有效，但是条件培养基要优于化学成分确定培养基（分子培养基），因而条件培养基是基于类器官的肿瘤发生分子机制研究和药物筛选的首选培养体系。图5 不同条件下的肿瘤细胞和正常上皮细胞的CA2和OLFM4的表达综上所述，该项研究对结直肠癌体内肿瘤组织、体内癌旁正常组织，以及配对的在两种不同培养体系中建立的肿瘤类器官、癌旁正常组织类器官进行了高精度单细胞转录组分析，并结合全基因组测序、全外显子组测序、DNA甲基化组测序以及靶位点Sanger测序的结果，系统地评估了类器官模型在研究结直肠癌肿瘤发生分子机制上的可靠性和局限性。该研究发现，现有的培养体系中的肿瘤类器官非常好地维持了对应结直肠癌患者体内癌细胞的关键生物学特征，现有的肿瘤类器官是肿瘤发生分子机制研究以及肿瘤杀伤药物筛选的优越平台。现有的培养体系使得正常肠上皮类器官也具有部分肿瘤细胞特征，因而无法用同一个患者得到的肿瘤类器官和正常肠上皮类器官进行配对筛选，以便得到对肿瘤细胞有选择性杀伤效果的候选药物。现有的两种培养体系对维持结直肠癌肿瘤细胞关键生物学特征都有效，但是条件培养基要优于化学成分确定培养基（分子培养基），因而条件培养基是结直肠癌肿瘤发生分子机制研究和药物筛选的首选培养体系。