小诺霉素中小诺霉素检测方案(离子色谱仪)

智能文字提取功能测试中

29001woThermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.SCIENTIFICPart of Thermo Fisher Scientific 关键词：离子对色谱；脉冲安培检测；小诺霉素；氨基糖苷类抗生素 Key words： lon-pair Chromatography； IPAD； Micronomicin；Aminoglycosides 引言 硫酸小诺霉素属氨基糖苷类抗生素，是中国自主研发的抗生素新药，被中国药典2010版收载，药典所用分析方法为液相分离——蒸发光检测器检测。但是蒸发光散射检测器在灵敏度和定量方面存在不足，我们开发了离子对色谱分离-柱后衍生-安培检测的方法，以提高杂质的检出程度，并制定新的定量方法。 目前欧洲药典测定庆大霉素等氨基糖苷类抗生素采用的也是离子对色谱分离柱后加碱衍生-安培检测方法，在该方法条件下，庆大霉素的有关物质和四种主要组分的分离度良好，检测的灵敏度大大提高。本文研究比对了检测小诺霉素的离子对色谱条件和检测模式，进一步优化分离和衍生生色谱条件，从分离度和灵敏度两个方面的数据来看，离子对色谱分离-柱后加碱-安培检测方法都显示了优越性且淋洗液中盐的浓度很高，适合用全peek材料的离子色谱来分析。 测试条件 仪器： ICS-5000型离子色谱仪(Thermofisher，美国)：电化学检测器，Au工作电极， Ti对电极， pH/Ag/AgCI复合参比电极， Chromeleon6.80色谱工作站，AS自动进样器； 精密量取本品适量，用水制成每1mL中约含小诺霉素150mg的溶液，作为供试品溶液。 精密量取供试品溶液适量，加水制成每1mL中约含小诺霉素15mg的溶液，作为对照溶液。 表1.氨基酸测定的六电位波形 时间 (s) 电位(V) 积分 0.000 0.130 0.040 0.130 0.050 0.330 0.210 0.330 On 0.220 0.550 On 0.460 0.550 On 0.470 0.330 On 0.560 0.330 0.570 -1.67 0.580 -1.67 0.590 0.930 0.600 0.130 结果和讨论 色谱柱的选择及淋洗液条件优化 Acclaim PA2 色谱柱是一种新型的亲水性硅胶反相色谱柱，与传统的C18填料的区别不仅在于碳链的长短不同，而且表现在其结构中嵌有极性较大的磺酰胺基团，这一结构上的特点决定了该色谱柱填料可以在一定程度上增强对极性化合物的保留，同时该色谱柱能够耐受低有机比例的淋洗液。小诺霉素等氨基糖苷类抗生素结构中一般含有三个氨基糖的结构，具有较强的极性，在普通反相柱上的保留较弱；同时连接氨基糖的碳链的长短和连接方式的不同又使得这类化合物之间的极性有明显的差异，在反相色谱柱上又具有不同的保留行为。综合上述因素，本文选用了Acclaim PA2色谱柱，所用的淋洗液含有少量离子对试剂，以增加氨基糖苷类抗生素在色谱柱上的保留，出于对色谱柱的保护加入了少量的乙腈。考察小诺霉素与其他氨基糖苷类抗生素的分离，结果表明，在此色谱条件下，小诺霉素与结构相近的抗生素西索米星和奈替米星具有良好的分离效果，在上述色谱条件下，小诺霉素的谱图如图-1。 线性、检出限和定量限 精密称取硫酸小诺霉素对照品适量，用水稀释并配制成浓度为10、20、50、100、150(pg/mL)的标准系列。精密量取25uL注入离子色谱仪，以峰面积Y为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归得回归方程：Y=1.3699X+9.5393， r=0.999， n=5；分别取同批样品6份，配制成150pg/mL浓度，精密量取25pL，注入液相色谱仪，记录色谱图，峰面积偏差RSD%=1.0%。取小诺霉素浓度约为0.5ug/mL溶液， 进样25uL，信噪比约为3，则小诺霉素的检出限为12.5mg/L。蒸发光检测检出限约为320mg/L，与现有的测定方法相比较，灵敏度得到很大提高。 破坏实验 对硫酸小诺霉素注射液分别进行了酸破坏、碱破坏、过氧化氢氧化破坏、加热破坏试验与光照破坏试验。具体如下：取硫酸小诺霉素注射液(1mL：30mg)2mL， 加30%双氧水4mL，沸水浴4小时，加水制成每1mL中约含小诺霉素150pg的溶液，作为氧化破坏供试样品溶液；取硫酸小诺霉素注射液(1mL： 30mg)2mL， 加10mol/L氢氧化钠2mL，沸水浴4小时，加水制成每1mL中约含小诺霉素150pg的溶液，作为碱破坏供试样品溶液；取硫酸小诺霉素注射液(1mL：30mg)2ml，加冰醋酸4 mL，沸水浴4小时，加水制成每1m中约含小诺霉素150pg的溶液，作为酸破坏供试样品溶液；取硫酸小诺霉素注射液(1mL： 30mg)2mL，置沸水浴4小时，加水制成每1mL中约含小诺霉素150pg的溶液，作为加热破坏供试样品溶液。结果表明：氧化破坏出的杂质量最多，且对应的色谱峰信号明显增大。 实际样品分析 用本实验方法对19批硫酸小诺霉素注射液进行了检查，以自身对照法计算，结果见表2。 序号 检品编号 生产企业 批号 最大杂质(%) 总杂质量(%) 1 2011C0538 制药厂1 1012301 3.31 11.45 2 2011C0542 制药厂1 1012101 2.58 9.42 3 2011C0563 制药厂1 1103101 3.71 10.67 4 2011C0602 制药厂1 1006291 2.96 9.30 5 2011C0606 制药厂1 1101131 2.61 9.38 6 2011C0608 制药厂1 1101242 2.68 11.38 7 2011C0627 制药厂1 1010131 2.55 8.92 8 2011C0628 制药厂1 1007141 2.42 8.34 9 2011C0639 制药厂1 1103021 3.23 11.84 10 2011C0640 制药厂1 1012211 2.31 9.27 11 2011C0555 制药厂2 11010731 2.38 8.81 12 2011C0607 制药厂2 11010731 2.38 9.21 13 2011C0630 制药厂2 10101511 3.10 9.58 14 2011C0641 制药厂2 10082411 3.21 9.97 15 2011C0853 制药厂2 1008811 3.31 10.21 16 2011C0565 制药厂3 10121501 2.42 10.15 17 2011C0605 制药厂3 10121501 2.43 9.45 18 2011C1192 制药厂3 1103041 4.18 11.53 19 2011C1533 制药厂19 1010051 3.54 8.90 三家企业的杂质种类比较集中，不同企业间以及同一家企业的不同批次间的杂质量的波动较大。这可能是生物发酵引入的。 《中国药典》中一般采用HPLC-ELSD方法测定该类抗生素的有关物质，一方面在流动相的选择上必须是易挥发的缓冲液；一方面检测器ELSD灵敏度不高，其峰面积对数与浓度对数成线性关系也使得操作和计算相对复杂。lon-pair-IPAD检测硫酸小诺霉素有关物质的方法稳定、可靠，为该类抗生素的有关物质检查提供了新的测定方法。 ( [1] . EUROPEAN PHARMACOPOEIA 7.3：3943 ) ( [21 . . . 中国药典二部，2005版：732 ) ( [3]. Dionex Corporation. AN 186 A nalysis ofParomomycin by HPAE-IPAD ) ( [4]..Valoran P. Hanko， Jeffrey S. Rohrer Journal of J. PHARM B.，2010，51(1)：96 ) ( [5] 江 . . V Valoran P. Hanko， Jeffrey S. Rohrer J. PHARMB.，2007，43(1)： 1 31 ) ( [6]. Ghinami C . ， G i uliani V . ， M e narini A. ， et . al.J.Chromatogra.A， 2007，1139(1)，：53 ) ( [7] . William R L.， Catherine O D . J o urnal of J.PHARM B.， 1999，19(1-2)，：239 ) thermoscientific.com ( C 2012 T h e rmo Fishe r Scie n tific Inc . Al l ri g hts reserved. All trademarks are the pro p erty of Thermo Fisher Scientific Inc. a nd i ts s ubsidiaries. Specifications， terms a nd p r icin g are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your ) local sales representative for details. 上海 北京 免费服务热线：上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 8008105118邮编：201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 400 6505118电话：021-68654588 邮编：100007传真：021-64457830 电话：010-84193588传真：010-88370548