阿托伐他汀中杂质检测方案(液相色谱柱)

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引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统定性检测阿托伐他汀药物杂质 摘要：本文建立了使用2D-LC-IT-TOF杂质鉴定系统定性检测阿托伐他汀药物中4个已知杂质(阿托伐他汀杂质A、阿托伐他汀杂质F、阿托伐他汀杂质G以及阿托伐他汀杂质H)和1个未知杂质(阿托伐他汀脱氢酸)的方法。该方法使用非挥发性的柠檬酸酸缓冲盐作为流动相对药物主成分和杂质进行了分离，并通过LCMS-IT-TOF在线对目标杂质进行MS定性分析。该系统由于无需将非挥发性缓冲盐转换为挥发性缓冲盐，因此，可以将药典的方法法接使用，大大节省了方法开发人员的时间，并且保证了杂质定性的准确度。 关键词： 阿托伐他汀杂质离子对试剂 2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统 目前，根据药典的规定和分离的要求，很多药品都在使用磷酸盐作为缓冲液或离子对试剂。但它们作为非挥发性的盐，不能进入质谱，这在极大程度上影响了质谱作为定性工具在药品杂质鉴定上的使用。在2DLC-IT-TOF使用之前，研究机构和药厂通过方法转换(将磷酸盐转换成挥发性缓冲盐)来实现质谱鉴定，但这是个费时费力的工程，并且有可能因为保留时间的改变而丢掉一些未知杂质。2DLC-IT-TOF 系统克服了这一局面，用户即使使用磷酸盐或离子对试剂，也可以在在使用 IT-TOF 进行杂质鉴定。本文使用 2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统定性检测了阿托伐他汀药物中4个已知杂质和1个未知杂质。供相关人员参考。 1实验部分 1.1仪器 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack VP-ODS， 4.6 mm I.D.×250 mm L.， 5 um 流动相A：柠檬酸缓冲液/乙腈/四氢呋喃=400/100/100(v/v)，(柠檬酸缓冲液：10.5g柠檬酸单水合物溶于900 mL 水中，28%的 氨水调 pH值到5.0，然后加水定容到1L) 流动相B：乙腈/四氢呋喃 =1/1(v/v) 时间程序：7%B(0~ 40 min)~40%B(40~80 min)~7%B (10.01~95 min) 流 速：1.3 mL/min 柱 温：40℃ 进样体积：20uL 检测波长：190~350nm (检测：254nm) 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 色 谱 柱： Shim-pack XR-ODS 2.0 mm I.D.× 离子源： ESI(+)， ESI(-) 50 mm， 2.2 um 离子源接口电压： ESI(+)，4.5kV； 流动相A：0.1%甲酸ESI(-)， -3.5kV；流动相B：乙检测器电压：1.7 kV时间程序： 10%B(0min)~ 90%B (10 min)~雾化化：氮气1.5 L/min10%B (10.01~20 min)干燥气：氮气10L/min流 速：0.3mL/min碰撞气：氩气柱 温：40℃脱溶剂管温度：200℃进样体积：5uL (Loop 环体积)加热模块温度：200℃检测波长：254nm质量数范围： m/z 200~800 质谱条件 多级质谱检测： Auto MS" 分析仪器： LCMS-IT-TOF 1.3 系统流路图 LC-20AD 图1.2D-LC-IT-TOF的系统流路图 1.4样品制备 使用流动相配制阿托伐他汀药物，样品浓度为1 mg/mL，过滤后进样分析。 本次实验涉及的药物主成分及已知的4个杂质的信息如下： 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 成分 中文名称 英文名称 分子式 分子量 CAS No. 结构式 主成分 阿托伐他汀 Atorvastatin C33H35FN205 558.64 110862-48-1 HC CHs oH 6H 8 已知 阿托伐他汀杂 Atorvastatin Amide C40H48FN30； 717.82 双. 杂质1 质F Acid 阿托伐他汀杂Atorvastatin Desfluoro 已知 杂质2 质A impurity C33H36N205 540.65 433289-83-9 HyC CH： on on 。 已知 阿托伐他汀杂3-O-Methylatorvastatin H H，C 杂质3 质G Lithium Salt C34H37FN205 572.67 887196-29-4 HC. 已知杂 质4 阿托伐他汀杂 质H Atorvastatin Lactone C33H33FN204 540.63 125995-03-1 2结果讨论 2.1 LC 1stD 分析结果 1stD 分析的主要目的为确定目标杂质的保留时间，以便于捕集到 LOOP环中，用于二维脱盐分析。本次实验 1stD色谱图如下，主成分和5个杂质的出峰时间分别为：17.361 min， 11.454min， 13.762 min， 14.436 min， 35.705 min 和 42.152 min， 其中R.T=13.762 min 的杂质为客户关注的未知杂质，其他4个为药典中报道的杂质。 图2. LC 1stD 分析色谱图 2.2LC 2stD分析结果 2.2.1已知杂质1的分析结果 已知杂质1(R.T.=11.454 min)切换到 LOOP环1中，经过2D LC分析， 得到 UV 色谱图、 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 MS 色谱图和质谱图如下。从MS 质谱图可以看出已知杂质1负离子模式m/z=716.3344，确证为阿托伐他汀杂质F， 分子式为 C40H48FN30g， 理论值[M-H]=716.3353，测试值与理论值质量数偏差为-1.26 ppm. 2.2.2已知杂质2的分析结果 已知杂质2(R.T.=14.436 min)切换到 LOOP 环3中，经过2D LC分析，得到 UV 色谱图、MS 色谱图和质谱图如下。从 MS 质谱图可以看出已知杂质2存在两个峰，正离子模式分别为m/z=541.2697 和 m/z=557.2446， 从LC 1stD 分析色谱图可以看到已知杂质2和未知杂质的保留时间差异不大，所以，可能有部分未知杂质切到 LOOP 3中，已知杂质2为阿托伐他汀杂质A，分子式为 C33H36N2O5， m/z=541.2697，理论值[M+H]+=541.2697，测试值与理论值质量数偏差为0.00ppm。 2.2.3已知杂质3的分析结果 已知杂质3(R.T.=35.705 min) 切换到LOOP 环4中，经过 2D LC分析，得到UV色谱图、MS 色谱图和质谱图如下。从 MS 质谱图可以看出已知杂质3正离子模式 m/z=573.2748，为阿托伐他汀杂质G， 分子式为 C34H37FN2O5， 理论值[M+H]+=573.2759，测试值与理论值质量数偏差为-1.92 ppm. 2.2.4已知杂质4的分析结果 已知杂质4(R.T.=42.152 min) 切换到 LOOP环5中，经过2D LC分析，得到UV 色谱图、MS 色谱图和质谱图如下。从MS 质谱图可以看出已知杂质4正离子模式m/z=541.2503，为阿托伐他汀杂质H， 分子式为 C33H33FN2O4，理论值[M+H]+=541.2497，测试值与理论值质量数偏差为1.11 ppm。 2.2.5未知杂质的分析结果 未知杂质 (R.T.=13.762 min)切换到LOOP环2中，经过2D LC分析，得到UV色谱图、MS色谱图和质谱图如下。 从 MS 质谱图可以看出未知正离子模式 m/z = 557.2449，相对于主成分阿托伐他汀(分子式 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 C33H35FN2O5，正离子模式 m/z=559.2603)少了2个质量数，可能是脱氢产物。经文献检索，未知杂质可能为阿托伐他汀脱氢酸，分子式为 C33H33FN2O5，，详细信息列于下表。 中文名称 英文名称 分子式 结构式 测试值 理论值 质量数偏差 [M+H] [M+HT (ppm) Atorvastatin Dehydro Acid H3C 阿托伐他汀脱 氢酸 C33H33FN205 5 ' HO、 OH OH 557.2449 557.2446 0.54 根据 MS2 的碎片信息，推测其裂解规律为： 3结论 色 谱 柱：Shim-pack VP-ODS, 4.6mm×250mm, 5μm流动相A：柠檬酸缓冲液/乙腈/四氢呋喃 =400/100/100（v/v）,（柠檬酸缓冲液：10.5 g柠檬酸单水合物溶于900 mL 水中，28%的氨水调pH 值到5.0，然后加水定容到1 L）流动相B：乙腈/四氢呋喃 = 1/1（v/v）时间程序：7%B (0 ~ 40 min) ~ 40%B (40 ~80 min) ~ 7%B (10.01 ~ 95 min)流 速：1.3 mL/min柱 温：40℃进样体积：20 μL检测波长：190 ~ 350 nm（检测：254nm）