喹诺酮类抗生素中毛细管电泳分离检测方案(毛细管电泳仪)

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合肥工业大学学报(自然科学版)JOURNAL OF HEFEI UNIVERSITYOF TECHNOLOGYVo1.32 No.8Aug.2009第32卷第8期2009年8月 田晶晶，等：高效毛细管电泳分离检测5种喹诺酮类抗生素第8期1171 高效毛细管电泳分离检测5种喹诺酮类抗生素 田晶晶. 邓 宁， 何建波 (合肥工业大学化学工程学院，安徽合肥 230009) 摘 要：采用高效毛细管电泳分离检测加替沙星、洛美沙星、依诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星等5种喹诺酮类抗生素，探讨了电泳参数对分离结果的影响。在检测波长为268nm时，确定最佳实验条件为：电泳缓冲液为pH值为8.8的15 mmol/L Na2B4O7-15 mmol/L KH2 PO4溶液，分离电压为8kV，高差为10cm，进样时间为20 s。在最佳分离条件下，5种抗生素在9 min 内实现基线分离，样品浓度在2×10-6~4×106mmol/L之间。同时，在最佳分离条件下检测市售洛美沙星片中洛美沙星的质量分数为36%，回收率为109.4%。 关键词：毛细管电泳；电泳参数；最佳分离条件；抗生素 中图分类号：0657.8 文献标识码：A 文章编号：1003-5060(2009)08-1170-04 Separation of five quinolones by capillary electrophoresis TIAN Jing jing， DENG Ning， HEJian-bo (School of Chemical Engineering， Hefei University of Technology， Hefei 230009 ， China) Abstract ：A high performance capillary electrophoresis (HPCE) method was developed for the simulta-neous determination of five quinolone antibiotics： gatifloxacin ， lomefloxacin， ciprofloxacin， enoxacinand ofloxacin. The separation efficiency was investigated under different electrophoresis conditions ，including the buffer system， buffer concentration and pH， separation voltage， and sampling time. Atthe detection wavelength of 268 nm， the electrophoresis parameters were optimized as follows： thebuffer was 15 mmol/L sodium borate-15 mmol/L potassium dihydrogen pho sphate at p H 8. 8， the sep-aration voltage was 8 kV and the sampling time was 20 s. The baseline separation was achieved for thefive quinolones within 9 min， with their detection limits being 2 ×10-6~4×10mmol/L. This meth-od was used to detect lomefloxacin in a commercial pill ，and a satisfactory result was obtained. Key words ：capillary electrophoresis； electrophoresis parameter； optimal separation condition； antibi-otics 喹诺酮类抗生素由于其抗菌谱广、吸收好、血液浓度高、能迅速分解到各组织、半衰期长等特点，被广泛应用于人体和家禽。但喹诺酮抗生素对人体有一定的副作用，因而肉类和蛋类中的喹诺酮药物残留量已引起人们的广泛关注11，2]。目前常规的分离方法有气相色谱法和高效液相色谱法11-5]，前者需要大量的样本和繁琐的提纯衍生等前处理过程，而后者大多需要复杂的前处理过程，且操作繁琐。毛细管电泳(CE)是20世纪80 年代迅速发展起来的一种分析分离技术，它具有高效、快速、节省样品和污染小等突出优点，在食品、医药和环境安全检测中的应用日益广泛16-91.近来国内外学者也将毛细管电泳应用于分离检测喹诺酮类抗生素。本文采用毛细管电泳-紫外检测法，对加替沙星、洛美沙星、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星5种喹诺酮类抗生素进行分离检测，系统地优化了操作参数，并用于检测市售洛美沙星片有效成分的实际质量分数。 ( 收稿日期：2008-09-27 ) ( 基金项目：国家自然科学基金资助项目(20776033) ) ( 作者简介：田晶晶(1984-)，女，河北唐山人，合肥工业大学硕士生； ) ( 何建波(1965-)，男，安徽太湖人，合肥工业大学教授，硕士生导师. ) 实 验 1.1 仪器与试剂 CL1020高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)，配紫外检测器；内径50um的熔融石英毛细管(河北永年光导纤维厂)；UV-2550型紫外可见分光光度计(SHIMADZU)。 加替沙星、洛美沙星、依诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星片均为市售品(合肥大药房)。洛美沙星对照品购于合肥市药品检验所。其他试剂均为分析纯试剂，实验用水为二次蒸馏水。 1.2 标准溶液的制备 洛美沙星母液的浓度为1.0 mmol/L，其他4种抗生素母液的浓度均为2.0 mmol/L。实验所用溶液使用前均用孔径为0.45um 的超滤膜过滤。5种抗生素在268 nm 附近都有较大吸收，因此选择检测波长为268 nm。每次开机前，毛细管依次用1 mol/L的 HCl冲洗5 min，二次蒸馏水冲洗5 min ，1 mol/L 的 NaOH冲洗 10 min ，二次 蒸馏水冲洗5min，最后再用缓冲溶液平衡10 min。两次进样之间毛细管都要用缓冲溶液冲洗2~3min。 2 结果与讨论 2. 1 电泳条件的选择 2.1.1 缓冲溶液体系的选择 因为缓冲溶液的类型会对电渗流、迁移时间、分离度等产生较大的影响，在其他实验参数相同条件下，分别考察了加替沙星、洛美沙星、依诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星5种抗生素在硼砂体系、硼砂-磷酸盐体系和磷酸盐体系的分离效果(分离电压为15kV)如图1所示。 从图1a可以看出，加替沙星与洛美沙星不能分离，依诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星不能分离；在图1b硼砂-磷酸盐体系中，5种样品分离较好；在图1c磷酸盐缓冲体系中，后3种抗生素不能实现基线分离。因此本实验采用硼砂-磷酸盐缓冲体系进行分离研究。 (b) Na2B4O7-KH2PO4缓冲溶液体系 (c)1.加替沙星 2.洛美沙星 3.依诺沙星 4.环丙沙星 5.氧氟沙星 图1 缓冲溶液体系(pH=8.5)对分离效果的影响 在缓冲溶液为 20 mmol/L Na2B407-20 mmol/L KH2PO4，分离电压为15kV，pH值在7.5~10.0的范围内，考察了缓冲溶液pH 值对分离度的影响，结果如图2所示。 图2 pH值对分离度的影响 从图2可以看出，当pH值小于8.0时，加替沙星与洛美沙星、依诺沙星与环丙沙星、环丙沙星与氧氟沙星的峰分离度较低。随着pH值由8.0增大到9.2，加替沙星与洛美沙星的分离度逐渐增大，依诺沙星与环丙沙星的分离度、环丙沙星与氧氟沙星的分离度均先增大后减小。综合考虑5种物质整体分离结果，选择缓冲溶液的最佳pH值为8.8. 实验考察了缓冲液浓度对分离效果的影响。实验结果表明，当浓度低于5 mmol/L时，由于缓冲容量较低，样品峰拖尾严重。当浓度从5mmol/L增加到15 mmol/L时，分离度逐渐得到改善，这是因为随着缓冲液浓度增加，电渗流速度降低，溶质在毛细管内的迁移时间延长。但当浓度大于15 mmol/L时，在相同的电场强度下毛细管中的电流值增大，焦耳热急剧升高，从而导致 样品峰展宽，柱效降低。因此选择缓冲液浓度为15 mmol/L。 2.1.3 分离电压的选择 缓冲溶液为15 mmol/L Na2B4O7-15 mmol/LKHzPO4，pH值为8.8的条件下，考察了分离电压的大小对各组分迁移时间和柱效的影响，如图3、图4所示。从图3可以看出，随着分离电压升高，各组分的迁移时间缩短，这主要是由于电渗流速度随着电压的升高而增大。同时，由图4可以看出，随着电压升高，产生的焦耳热也快速增加而难以有效驱散，柱效降低。 16 图3 分离电压对迁移时间的影响 图4 分离电压对柱效的影响 综合考虑分离电压对迁移速度及柱效的影响，选择最佳分离电压为8kV。 2.1.4 进样时间的选择 采用高差进样，高度设置为10 cm，随着进样时间增大，5种组分的峰都明显增高，样品检测灵敏度得到改善，但当进样时间大于20s时，峰有所展宽，柱效降低，因此选择最佳进样时间为20s。 综上所得，毛细管电泳分析5种抗生素的最佳实验条件为：在268 nm 检测波长下，电泳介质为pH 值为 8.8 的 15 mmol/LNa2B407-15 mmol/L KH2PO4 溶液，分离电压8kV，重力高差10 cm进样20s。最佳实验条件下，5种抗生素的毛细管电泳分离谱图如图5所示，从图5可以看出，5种物质在9 min 内实现基线分离。 4.环丙沙星5.氧氟沙星 图5 5种喹诺酮抗生素高效毛细管电泳谱图 2.2 检测线性范围、重现性和检出限分析 配制一系列不同浓度的混合标准溶液进样，测定信号强度与浓度的关系，得到5种组分的线性范围、回归方程、相关系数和检出限(S/N=3)，见表1所列。 样品 线性范围 /(×10-5 mol ·L-1) 线性回归方程 相关系数 检测限 (X10-6mol·L-1) 加替沙星 1~10 Y=16.82X—0.063 0.999 4 洛美沙星 1~10 Y=24.65X+0.084 0.994 4 依诺沙星 1~10 Y=17.20X—0.053 0.990 4 环丙沙星 1~10 Y=40.42X+0.155 0.997 2 氧氟沙星 1~10 Y=14.57X+0.079 0.998 4 在上述优化的实验条件下，将混合标准溶液连续进样8次，迁移时间的相对标准偏差分别为：加替沙星(0.78%)洛美沙星(0.79%)、依诺沙星(0.83%)、环丙沙星(0.87%))和氧氟沙星(0.92%)。信号强度的相对标准偏差分别为：加替沙星(5.66%)洛美沙星(5.62%)、依诺沙星 (3.76%)、环丙沙星(3.03%)和氧氟沙星(5.67%)。 2.3 实际样品检测 利用最佳电泳条件对洛美沙星片进行检测，根据洛美沙星片的信号强度与洛美沙星标准物的 运营商开始展开价格竞争的市场实践。本文从博弈分析的角度，结合电信市场的市场结构演变，尝试对电信市场的价格竞争对策进行探讨。 研究结果表明，当电信增值服务市场需求不大于每个电信运营商的增值服务量时，电信运营商的最优定价将围绕其增值服务单位价格成本与电信增值服务市场最高限价之间的平均值小幅波动；当电信增值服务市场存在相对垄断的电信运营商时，非垄断电信运营商会以单位价格成本定价来获取增值服务的机会，而相对垄断电信运营商利用其主导地位提高边际价格；当电信增值服务市场需求大于每个电信运营商的增值服务量而小于所有电信运营商增值服务量之和时，若不受管制，双方定价将趋于无穷大，若受限制，每个电信运营商的最优均衡定价可能存在3种情况之一：该电信运营商的增值服务单位价格成本、电信增值服务市场最高限价以及两者之间的平均值波动。 ( [参 考 文 献] ) ( [1] 张 蓓.电信市场价格竞争的博弈分析[J].中国物价， ) (上接第1172页) 线性回归方程计算得到洛美沙星片的有效成分质量分数为36%，回收率为109.46%。 3 结 论 本文通过对电泳条件的优化，找到了一种快速分离检测加替沙星、洛美沙星、依诺沙星、环丙沙星和氧氟沙星等5种喹诺酮类抗生素的有效方法。在检测波长268nm下，所得到的最优化分离条件：电泳介质为pH值为8.8的 155mmol/LNa2B407-15 mmol/L KH2PO4溶液，分离电压8kV，高差10cm进样20s。 将该方法应用于检测市售抗生素药品，结果满意，表明该方法具有实用价值。 ( [参 考 文 献] ) ( [1] Andreu V ， Blasco C， Pic 6 Y . 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