饲料中维生素B12检测方案(液相色谱仪)

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【仪电分析】预混合饲料中维生素B12的测定高效液相色谱法 维生素B12不仅参与牲畜、禽类、鱼类体内碳基团的代谢，而且参与牲畜、禽类、鱼类核酸和蛋白质的合成，促进了细胞的发育和成熟，使牲畜、禽类、鱼类增重加快。当维生素B12缺乏时，糖在牲畜、禽类、鱼类组织中的利用过程发生障碍，牲畜、禽类、鱼类表现为食欲减退，生长慢或失重，严重消瘦，异食癖和极度贫血死亡。所以维生素B12添加剂作为牲畜、禽类、鱼类饲料中必不可少的成分，在饲料产业中有着广泛的应用。 本实验参考 GB/T 17819-2017 《添加剂预混合饲料中维生素B12的测定高效液相色谱法》，本方法适用于复合预混料饲料、维生素预混合饲料中维生素B12的测定。 一、方法原理 维生素预混料用流动相提取，试液注入高效液相色谱柱，用紫外检测器在361nm 处测定，外标法计算维生素B12的含量。 二、主要仪器及试剂 a. 高效液相色谱仪：L220，带紫外检测器； b. 超声波水浴； c. 自动进样器； d. 电子天平； e. 针式过滤器； f. 乙腈：色色谱纯； g. 甲醇：色谱纯。 三、实验方法 3.1色谱参考条件 色谱柱：： Welch C18， 200 mmx4.6 mmx5um； 进样量：： 10pL； 流动相：水+乙腈 时间梯度0-10min 5%乙腈，，10-25 min 5%→35%乙腈，25-30 min 35%乙腈， 30-35 min 5%乙腈； 流速：1.0mL/min： 柱温：30℃； 波长：361nm； 3.2维生素B12标准工作液配置 将0.1g维生素B12标准物溶于100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，使该标准储备液的浓度为100 ug/mL。置4℃冰箱保存，可保存期3个月。 分别配置浓度为 5 ug/mL、10 ug/mL、20 ug/mL、50 ug/mL、100 ug/mL的工作液，待上机。 3.3试样溶液的制备 称取维生素混合饲料 0.10g， 精确至 0.0001 g， 置于 100 mL棕色容量瓶中，加入100 mL水，在超声波提取器中超声提取 15 min， 取适量溶液离心后取上清液，过滤，滤液过 0.45 um(或0.20um)滤膜，待上机。 测定：取相同体积试样制备液和标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间按定性，峰面积外标法定量。 四、实验结果 4.1标准工作曲线的绘制 维生素B12工作曲线见图1： 维生素B12标准曲线 图1维生素B12工作曲线 4.2标准工作液色谱图 标准工作液色谱图见图2 图2标准工作液色谱图 4.3预混料实际样品色谱图 实际样品色谱图见图3： [mV] 图3实际样品色谱图 4.4计算 (S×0.00007+0.39474)×100×100000= 10000 =(472426.938×0.00007+0.39474)×100 =33.4646g/kg 【仪电分析】预混合饲料中维生素B12的测定高效液相色谱法维生素B12不仅参与牲畜、禽类、鱼类体内碳基团的代谢，而且参与牲畜、禽类、鱼类核酸和蛋白质的合成，促进了细胞的发育和成熟，使牲畜、禽类、鱼类增重加快。当维生素B12 缺乏时，糖在牲畜、禽类、鱼类组织中的利用过程发生障碍，牲畜、禽类、鱼类表现为食欲减退，生长慢或失重，严重消瘦，异食癖和极度贫血死亡。所以维生素B12 添加剂作为牲畜、禽类、鱼类饲料中必不可少的成分，在饲料产业中有着广泛的应用。本实验参考GB/T 17819-2017 《添加剂预混合饲料中维生素B12的测定 高效液相色谱法》，本方法适用于复合预混料饲料、维生素预混合饲料中维生素B12的测定。一、方法原理 维生素预混料用流动相提取，试液注入高效液相色谱柱，用紫外检测器在361nm处测定，外标法计算维生素B12的含量。二、主要仪器及试剂a. 高效液相色谱仪：L220，带紫外检测器； b. 超声波水浴；c. 自动进样器；d. 电子天平；e. 针式过滤器；f. 乙腈：色谱纯；g. 甲醇：色谱纯。三、实验方法3.1 色谱参考条件色谱柱：Welch C18，200 mm×4.6 mm×5μm；进样量：10 μL；流动相：水+乙腈时间梯度0-10 min 5%乙腈，10-25 min 5%→35%乙腈，25-30 min 35%乙腈，30-35 min 5%乙腈；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；波长：361 nm；3.2 维生素B12 标准工作液配置将0.1 g维生素B12 标准物溶于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，使该标准储备液的浓度为100 μg/mL。置4 ℃冰箱保存，可保存期3个月。分别配置浓度为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的工作液，待上机。3.3 试样溶液的制备称取维生素混合饲料0.10 g，精确至0.0001 g，置于100 mL棕色容量瓶中，加入100 mL水，在超声波提取器中超声提取15 min，取适量溶液离心后取上清液，过滤，滤液过0.45 μm（或0.20 μm）滤膜，待上机。测定：取相同体积试样制备液和标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间按定性，峰面积外标法定量。四、实验结果4.1 标准工作曲线的绘制维生素B12工作曲线见图1： 图1 维生素B12工作曲线4.2 标准工作液色谱图标准工作液色谱图见图2 图2 标准工作液色谱图4.3 预混料实际样品色谱图实际样品色谱图见图3： 图3 实际样品色谱图4.4 计算