【资料】一种可用于农残检测和分离的新技术---分子印迹聚合物（MIP）

3．分子印迹聚合物的制备

分子印迹聚合物的制备一般要经过以下三个步骤：（1）使模板分子和单体分子间产生互补的相互作用，形成复合物；（2）加入交联剂，在模板-单体复合物周围进行本体聚合反应；（3）除去聚合物中的模板分子。由于在聚合过程中模板分子的加入，当洗去聚合物中的模板分子后，在模板聚合物中就会留下一些空穴，其大小，形状及官能团的分布与模板分子具有互补性，因而对模板分子具有选择性。其过程就象烙印一样，在聚合物上留下模板分子的印迹，所以称分子印迹聚合物（molecular imprinted polymer，MIPs）[6]。影响MIPs选择性和亲和性的主要因素由印迹分子、功能单体、反应溶剂（致孔剂）和反应条件（引发剂）等。

3.1选择印迹分子
可用于分子印迹的分子很广泛,如药物,氨基酸,碳水化合物,蛋白质,核酸,激素,杀虫剂,酶或辅酶等均已成功地用于分子印迹的制备中。一般地，分子中含强极性基团的化合物易于制备高效能的MIPs。由于氢键具有饱和性和方向性，作用力较强，因此能与功能单体间形成氢键的印迹分子往往能产生选择性和亲和性的 MIPs[25]。

3.2选择功能单体
功能单体的选择主要由印迹分子的结构或官能团决定，它首先必须能与印迹分子成键，且在反应中它与交联剂分子处于合适的位置才能使印迹分子获得期望的取向和定位。分子印迹聚合中应用最广的聚合单体是羧酸类(如丙烯酸,甲基丙烯酸,乙烯基苯甲酸), 磺酸类,以及杂环弱碱(如乙烯基吡啶,乙烯基咪唑)。其中最常用的体系为聚丙烯酸和聚丙烯酰胺体系。对金属配合作用则应用氨基二乙酸衍生物。其它可能的体系为聚硅氧烷类。


图3常用的功能单体[10]

3.3选择交联剂
为了使生成的MIPs具有一定的硬度（特别是用于HPLC）和形成稳定的结合位点，分子印迹聚合物要求的交联度很高(70～90%)[15],因此交联剂的种类受到限制,预聚溶液中交联剂的溶解性减少了对交联剂种类和浓度的选择。起初人们用二乙烯基苯为交联剂,但后来发现丙烯酸类交联剂能制备出更高特异性的聚合物。在肽类分子印迹中三或四官能交联剂如季戊四醇三丙烯酸酯（PETRA）和季戊四醇四丙烯酸酯(PETEA)已用于聚合体系中。本试验所采用的乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）应用最多，制备的MIPs选择性高，非特异性吸附低。

图4 常用的交联剂分子结构[21]

3.4选择溶剂
溶剂的选择在分子印迹制备中发挥着重要作用,对分子间作用力和MIPs的形态影响很大，还起着致孔剂的作用。选择的溶剂要满足以下3个条件：（1）能溶解模板分子和功能单体；（2）能形成大的流通孔，从而保证流动相能在较低的压力下流过色谱柱；（3）对模板分子与功能单体之间的相互作用干扰小。须根据印迹分子与功能单体间可能的作用力类型选择适宜极性的溶剂。一般说来,溶剂的极性越大,产生的识别效果就越弱。因此最好的溶剂应选择低介电常数的溶剂,比如甲苯和二氯甲烷等。应用极性强的溶剂会不可避免地减弱印迹分子与单体间的相互作用,从而导致弱的识别。另外,聚合物的形态学也受溶剂的影响。溶剂能使聚合物溶胀,从而导致结合部位三维结构的变化,对分析物的识别作用减弱。通常,吸附中溶剂最好与聚合反应溶剂相一致,以避免任何溶胀问题。目前，尽管在水相中进行的非共价型印迹已取得成功,但是通常还是选用苯、甲苯和氯仿等这些非极性或者弱极性、非质子传递的溶剂作为生孔剂。本试验就是采用氯仿作溶剂。

3.5反应条件
MIP都是通过自由基引发制备的,一般以偶氮二异丁腈（AIBN）或偶氮二异庚腈为引发剂,引发剂的引发有高温热引发和低温光引发两种形式[15]。低温光引发具有下述特点：（1）可稳定模板分子和单体所形成的复合物；（2）可印迹热不稳定的化合物；（3）可以改变聚合物的物理性能以获得更好的选择性。因而低温光引发的应用更为广泛。同时，为消除空气（氧气）对反应的影响，聚合反应引发前需对反应液进行超声处理并向反应容器充氮气。

3.6印迹分子的提取
最后需要除去MIPs中残余的印迹分子，通常采用乙腈、水、甲醇-乙酸、乙腈-乙酸等高极性溶剂反复洗涤MIPs以彻底出去印迹分子。洗涤过程通常非常缓慢并需要耗费大量的溶剂，可用索氏提取器进行连续回流和萃取，寻找一种快捷、彻底的洗涤方法对简化MIPs的制备过程很重要。本试验采用的是反复超声、离心，除去上清夜进行提取的。

3.7分子印迹聚合物的形态
分子印迹聚合物的形态有聚合物块、珠、薄膜、高分子表面印迹以及在固定容器内的就地聚合等。目前最常规的工艺是制备整块聚合物,然后粉碎后过筛,获得不同粒径的颗粒。用于层析时,聚合物也可在层析柱中就地聚合。由于层析性质依赖于聚合物的粒径和形状,因此,应用乳液聚合,悬浮聚合,分散聚合可获得粒径较均一的颗粒。浇铸膜等聚合物薄膜可用于制造器件或传感器。
本体聚合 这是一种最常用的方法,即先合成呈块状的MIP,再经反复的研磨和筛分,选择粒径小于25um的颗粒用于色谱研究。这种固定相已用于HPLC和TLC的研究中。本体聚合的方法简单,优化印迹条件比较直接。但通常存在以下几个缺点：（1）后处理过程繁杂，反复研磨和筛分费时、费力、产率低（通常小于50%）；（2）所得颗粒为无定形,粒径是高度分散的,在一定程度上限制了它的柱效率和分辨率；（3）大规模生产有困难（4）印迹点在合成过程中被包埋在聚合物内部，使得其利用率低，表现为低地吸附量；（5）对于某一应用来说除分子识别性质外，调节聚合物的其他性能是非常困难的。例如HPLC要求材料具有较大的硬度但脆性的高交联网络是做不到的。所以用这种方法制备出的聚合物一般只能用于痕量物质的检测，限制了在其它领域的应用。尽管如此,由于其固有的高选择性,对映异构体在这类固定相上也获得了完全的分离。
表面聚合 通过对粒子表面进行修饰制备分子印迹聚合物材料是一个较好的方法[18]，这种方法最大的优点是以利用粒子的机械稳定性，并且可以通过对粒子本身性能的调节来适应应用的需要。
悬浮聚合 悬浮聚合法是制备聚合物微球最简便、最常用的方法之一，通常使用的单体是疏水性的，所以连续相常用水或高极性的有机溶剂。但对于分子印迹聚合物的合成，这些溶剂是不适宜的，因为高极性溶剂会极大地降低功能单体与印迹分子间相互作用的数量与强度，从而影响聚合物对印迹分子的识别能力；另一方面，酸性单体在水中的溶解度过高，使单体与交联剂间的无规共聚很难进行，并且水溶性印迹分子会在水相中损失，所以很难用水相悬浮聚合制备分子印迹聚合物。
为了克服水或高极性有机溶剂的干扰问题，人们提出以全氟烃为分散相的悬浮聚合法[19]，即在液态全氟烃中形成非共价印迹混合物乳液，采用氟化的表面活性剂及其它含氟的表面活性聚合物作为稳定剂，得到稳定的含单体、交联剂、印迹分子、致孔剂的乳液液滴。这种方法可以直接制得聚合物微球，解决了聚合物需要研磨的问题。但由于最后产物仍为高交联凝胶，其结合位点的可近性及印迹分子的回收率仍不能令人满意。另外，这种方法虽然可以控制微孔的大小和粒径分布，但很难控制聚合物的结构和交联密度，不利于印迹分子的重新结合。因此，虽然此法是一种有益的尝试，但与无定型材料相比它对聚合物的物理性能没有明显改进[16]。
原位聚合 在色谱柱上或管内直接合成MIP固定相的方法，可以得到连续棒状聚合物，使用前只需进行洗涤，避免了粉碎和装柱程序，由于其直接、简便的特点,具有很强的实用性。但是棒状分子印迹固定相对小分子物质的柱效率低，在HPLC中的使用寿命不够长，有必要进行进一步的研究，以适合实际应用的需要。
乳液聚合 乳液聚合法制备的聚合物是一类新的、有用的载体，粒子为纳米级50-500nm这类材料的显著特点是表面积大，遗憾的是纳米材料对色谱来说是不适用的。因此，既有大的表面积，又适合色谱应用的材料非常引人注目[17]。

4.应用范围

运用分子印迹技术制备的分子印迹聚合物具有多方面的应用，
4.1 色谱分离
MIP作广泛的研究领域之一是利用它的特异性去分离混合物。近年来，引人注目的立体、特殊识别位选择性分离已被完成。其适用的印迹分子范围宽广，无论是小分子（如氨基酸、药品和碳氢化合物），还是大分子（如蛋白质）已经被用在各种印迹技术中，并且将制备的介质用在HPLC、TLC和CE分离中。主要有以下两方面的工作：样品前处理（分离、提纯、浓缩）和手性物质的分离[12]。

4.1.1 样品前处理
分子印迹聚合物作为吸附剂,真正用于试样的前处理是Sellergren[13]于1994年首先报道的以他合成的五咪(pentamidin,一种抗原虫菌药)为模板的印迹聚合物,该聚合物作为吸附剂完成了对生物液体试样尿中五咪的提取、纯化和浓缩,使之达到能够被直接检出的浓度。Martin[14]等人指出了印迹聚合物作为固定相时存在的困难: 1）印迹聚合物具有很大程度的非专一性吸附,这对分离工作十分不利。虽然他们通过加TEA等离子修饰物克服了这一困难,但洗脱条件控制严格,给应用带来了许多不便。 2）回收率不能到100%,而且回收率不能控制在一个准确值,从而影响定量分析,特别是痕量分析工作的准确性。迄今为止,分子印迹技术结合固定相色谱对分析样品进行前处理的研究已作了很多工作。目前的研究表明分子印迹聚合物-固定相色谱完全能运用于分析试样的分离、纯化和浓缩工作[12]。但这方面的研究仍处于初级阶段,尚有许多不完善的地方。

4.1.2 手性异构体的分离
在天然和合成的药物中有许多手性化合物，其对映体的药理活性和毒性往往有很大差异，有时甚至性质相反，因此对映体的分离非常重要。然而由于对映体的结构非常相似，分离相当困难。分子印迹技术为手性分离提供了一种非常简单的解决办法。现己有各种氨基酸、多肽、和多种药物分子的对映体可被MIPs分开[15]。

4.2 固相萃取剂
固相萃取是临床药物分析常用的富集方法。但常规的基于反相或离子交换作用的固相萃取剂选择性较差，给后面的HPLC分析造成较大困难。利用MIPs的分子识别能力，可望实现有选择的固相萃取，在富集待分析药物的同时，除去大部分干扰物，从而方便后面的HPLC分析，甚至可不经HPLC直接检测分析。而且由于印迹聚合物既可在有机溶剂中使用,又可在水溶液中使用,故与其他萃取过程相比,具有独特的优点。

4.3 抗体/受体结合模拟
由分子印迹制备的人工抗体或受体对其印迹分子具有互补性，分子印迹聚合物可以作为天然抗体的描述模型，它用于放射免疫测定时所引起的交叉反应同单克隆抗体一致。由于其物理化学性质稳定，保证了识别性质的高度稳定性。用anti-theophylline的模板聚合物测定病人血清样品中的theophylline的浓度，表明模板聚合物可作为抗体的替代物用于常规免疫分析，而且它比抗体要稳定[20]。

4.4 仿生传感器
传感器在医药、环保、化工等领域的应用，要求传感器有一定的选择性。酶或抗体等生物大分子作为传感器的分子识别元件可使传感器具有较好的选择性。但酶的不稳定性、不耐有机溶剂等缺点限制了它的应用。由于MIPs不受酸、碱、热及有机试剂等各种环境因素的影响。因此，MIPs传感器兼备生物传感器和化学传感器的优点，是未来传感器发展的方向。化学或生物传感器由分子识别元件和信号转换器(如电极、光极、场效应晶体管、压电晶体、热敏电阻等)组成。通常为了获得最大的响应和最小的干扰，或便于重复使用，一般将MIPs传感器的识别元件以膜或粉末形式通过适当的方式固定在转换器表面。目前已用MIPs膜传感器的分析物及转换器见图5。

4.5 模拟酶催化
化学模拟酶催化剂与天然的生物酶催化剂相比，具有抗恶劣环境的能力，表现出高度的稳定性和长的使用寿命，而分子印迹技术则是设计新型人工模拟酶材料的最有效手段之一。例如，以P-nitrophenol methylphosphonate为模板分子制得MIP，可对P-nitrophenol acetate的酯解有催化活性。

4.6 药物控制释放
印迹高聚物可以吸收大量于印迹分子结构相似的物质，可以被用来作为一种反应性控制释放载体。有人通过实验,初步提出了药物控制释放机理[9],以某种印迹分子为模板制得的印迹高聚物载着一定量的与该种印迹分子结构相似的药物分子,这种聚合物在该印迹分子存在的溶液中可以加速药物分子的释放。可以想象,这种吸附有药物分子的高聚物进入人体后,如果人体内存有该种印迹分子,则其会同药物分子对高聚物产生竞争性吸附,从而导致药物分子的逐步释放。当然该高聚物应是可体内降解的。

5.前景与展望

合成高度交联的MIPs与生命体中识别体相比具有独特的化学、机械、热稳定性,不会发生膨胀和收缩。用于制备MIPs的原料廉价易得。模板分子可以回收进行重复利用,降低了MIPs的生产成本。特别是在当使用非共价型印迹方法设计合成的表面固载手性固定相时,MIPs的制备简单,易于放大生产,并且可以预先确定其选择性,显示出独特的优越性。
MIP的一些缺点也是显而易见的：
5.1 分子印迹过程和分子识别过程的机理和表征问题，尽管有不少研究者在这方面作过努力，但结合位点的作用机理，聚合物的形态和传质机理仍然是研究者们所关注的问题。如何从分子水平上更好地理解分子印迹过程和识别过程，仍需努力。
5.2 低质量的等温吸附和缓慢的传质是限制其作为分离介质的两个主要因素。当溶剂组成改变时，MIPs容易发生膨胀，常导致印迹空穴的不可逆变形，从而失去选择性。
5.3 制备MIPs大都是在有机溶剂中进行，存在不便。因而，改善MIPs的动力学性能，设法在水溶液或水溶性介质中进行合成，优化空间几何因素设计等研究，均待深入开展。
5.4 目前使用的功能单体、交联剂和聚合方法都有较大的局限性。尤其是功能单体的种类太少以至于不能满足某些分子识别的要求，这就使得分子印迹技术远远不能满足实际应用的需要。因此，有待发展基于新的功能性单体的有机聚合物，用以代替常用的丙烯酸类和二乙烯基类单体。最近虽已提出聚酚、聚氨苯基硼酸酯、过度氧化的聚吡咯、聚氨酯、聚苯二胺、聚苯二胺、聚苯胺等，但仅能适应相应特殊要求，性能尚待完善。
5.5 用于生物传感时，与生物传感器相比的相对噪音较高，灵敏度较低[6]。

展望未来，分了印迹技术的发展趋势可能有如下几个方面： （1）分子印迹和识别过程的机理将从目前的定性和半定量描述向完全定量描述发展，从分子水平上真正弄清楚印迹和识别过程。 （2）合成更多更有用的功能单体和交联剂，以满足分子印迹和识别的需要。 （3）分子印迹和识别过程将从有机相转向水相，以便完全能够达到与天然分子识别系统相媲美的完美境地。 （4）手性分离和固相萃取氨基酸、手性药物将步入商业化阶段。 （5）印迹技术将从氨基酸、药物等小分子、超分子过渡到核苷酸、多肽、蛋白质等生物大分子,甚至生物活体细胞。 （6）由于MIPs具有特殊的预定性，将MIPs用于催化合成将是一个倍受关注的领域。 （7）由于MIPs仿生传感器既具有抗各种恶劣环境的能力，又具有与生物酶类似的高选择性。利用这两个性质可以将MIPs传感器做成分子探针，可以直接插入生物组织或细胞内进行探测和分析。
总之,随着生物技术、电子技术、合成手段和现代分析检测手段的迅猛发展，MIPs的合成、表征方法和理论系统将日臻完善，其应用范围将更加广泛。

写的很不错，前段时间做了一下，的确效果不错。就是现在制备的条件需要一些优化，如温度、时间、比例以及模板的去除，洗脱条件等等。如果你有好的实践经验，不妨也介绍一下，非常感谢！

好，把实验条件跟你交流一下：
称取0.3505g模板分子***、0.4305g反应单体甲基丙烯酸(MAA)、3.9600g交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、0.0100g引发剂偶氮二异丁腈，10ml致孔剂二氯甲烷，混合均匀，装入20ml安培瓶中，通入氮气5分钟，密封，在365nm波长紫外灯下聚合，温度用冷水浴控制在8℃，反应24小时。
待聚合后，将聚合物取出，研磨，用甲醇浸泡，干燥，过筛。先用甲醇100ml清洗，再用4×100ml甲醇:乙酸（体积比8.5:1.5）的混合溶液超声清洗，---每部分洗脱液浓缩，高效液相色谱紫外检测进样，至在最大吸收波长处检测不到模板分子，干燥

能透露一下你的产品，样品净化效果好吗？
我做了氯霉素-MIP，用热聚合，有一缺点就是，样品过柱后，用甲醇洗脱时，有很多柱子里的东西同时洗脱，是否聚合不彻底，或者前面甲醇淋洗不彻底？或者还有其他原因？

是有机磷，效果应该算是一般
不知道你的柱子是指的液相色谱柱还是SPE柱？柱子是原位聚合还是装填的?

是有机磷，效果应该算是一般
不知道你的柱子是指的液相色谱柱还是SPE柱？柱子是原位聚合还是装填的?

是SPE柱，用于氯霉素样品净化，柱子是填装的，净化效果倒是很不错。问题就是聚合物容易溶于甲醇。