【资料】-农药残留的安培检测法

1 　应用常规工作电极的安培检测法
　　用于农残分析的三电极安培检测体系中的常规工作电极多为滴汞电极和悬汞电极。

邱萍等用滴汞电极为工作电极、Ag/AgCl 为参比电极、铂丝为辅助电极,研究了杀虫剂甲基对硫磷的电化学性质。线性扫描伏安法研究结果表明,甲基对硫磷在汞电极上具有吸附性,为不可逆的电极反应;在pH = 10.38 的Britton-Robinson 缓冲溶液中,研究者采用微分脉冲溶出伏安法,在最佳实验条件得到甲基对硫磷的线性范围为0.1-1.4 mg/L ,最低检测限为0.058 mg/L 。实验还对水果及水样中的甲基对硫磷残余量进行了测定,除水果色素外,水中常见的无机离子以及水果中的糖类物质都不会干扰样品的测定。

相似的电化学体系也被用于有机磷农药水解产物、杀菌剂三环唑和仿生性农药杀虫单等的电化学行为和定量检测方法研究。

Oudou 等以四丁基氯化铵溶液作为支持电介质,在不同pH 值的Britton-Robinson 缓冲溶液中应用循环伏安法研究了悬汞电极上高效氯氟氰菊酯的电化学行为,结果发现其在悬汞电极上为不可逆还原。应用差分脉冲伏安法在pH = 2 的条件下测得样品检测限为2.5μg/L ,方法重现性良好。对于水样和土壤样品, 其线性范围分别为0.05 —0.5μg/L 和0.05 —0.5μg/g。

顾海宁等研究了有机氯杀虫剂噻满酮在悬汞电极上的吸附伏安行为,并建立了噻满酮的线性扫描吸附伏安分析方法, 噻满酮的浓度在0.4-20mg/L 范围内与峰高呈线性关系, 检出限为0.08mg/L。Guzsvány 等以悬汞电极为工作电极,应用差分脉冲极谱法得到噻虫嗪的检测限为9.3ng/ml ,并同时采用紫外分光光度法、高效液相色谱法以及实验所得的电化学方法,对经过破碎、萃取等预处理的土豆样品进行了噻虫嗪检测。实验结果表明电化学安培法对噻虫嗪的检测灵敏度比其它两种仪器分析方法约高出10 倍。

2 　应用修饰工作电极的安培检测法
　　以滴汞或悬汞电极作为工作电极,采用常规脉冲和示差脉冲技术对样品进行测定的方法是直接测定浓度的最灵敏的手段。但由于使用该方法一般需要较长的分析时间,且汞具有毒性不利于现场检测,因此目前的研究多集中在对其它常规工作电极的修饰方面,以此提高检测的选择性和灵敏度。

2.1 　物化法修饰工作电极的应用
由于许多有机磷农药如杀螟硫磷、对硫磷等降解会产生42硝基苯酚,因此通过测定其水解物也可以间接获知农药的含量。Pedrosa 等通过方波伏安法以掺硼金刚石薄膜(boron-doped diamond , BDD)作为工作电极、Ag/AgCl 为参比电极、Pt 为对电极组成三电极体系,对4-硝基苯酚进行了分析,并与悬汞电极作为工作电极的检测结果进行了比对。以Britton-Robinson 缓冲液作为电解液,以方波伏安法的还原过程定量。结果表明采用悬汞电极所得4-硝基苯酚的定量限根据水样污染程度的不同在5.7-60μg/L之间,而应用BDD 电极的定量限相应地分布
于14.1-6.13μgPL 。实验还发现,以BDD 电极上的氧化峰定量可使4-硝基苯酚的检测限降低到9.4-53.1μg/L 。由于样品中可能含有的无机离子在分析范围(0.8 —1.15V, vs. Ag/AgCl) 内没有电化学活性,而且BDD 对其它有机物的吸附更少,因而在实验所给出的氧化电位处测定污染程度严重的样品如废水中的有机磷农药,BDD 电极要优于悬汞电极。

由于纳米材料具有高比表面积以及特殊的表面活性,因此已被许多研究者用作农残检测电化学传感器的修饰材料,以提高目标物的检测灵敏度。为提高有机磷农药检测的选择性和降低检测限,Liu等利用氧化锆对磷酸根的强亲和作用,在氧氯化锆溶液中以电化学沉积的方法给常规金电极表面修饰上氧化锆纳米颗粒。用该法制得的ZrO₂/PAu 电极作为工作电极、Ag/AgCl 为参比电极、Pt 电极为对电极组成三电极体系研究了甲基对硫磷的循环伏安特性,结果发现该体系在KCl 溶液中于0.093V 与0.037V(vs. Ag/AgCl ) 处出现一对可逆的氧化还原峰、- 0.61V(vs. Ag/AgCl) 处有一个不可逆还原峰。实验中采用溶出伏安法(吸附2min) 可以使甲基对硫磷的检测限达到3 ng/ml ,随着吸附时间的延长检测限还可被进一步降低。Siswana 等将具有强电化学活性的FePc (iron ( Ⅱ) phthalocyanine) 纳米粉末与经过活化的石墨粉和矿物油以一定的比例混合,制成纳米FePc 修饰的糊状碳电极,用其作为工作电极检测除草剂氨基三唑。凭借修饰材料中Fe²⁺ 的电化学氧化产物Fe³⁺来催化氧化氨基三唑,可以使氨基三唑的氧化峰电流显著增强,从而使得采用计时安培电流法所得目标物的检测限可以降低到3.6nmol·L ^{- 1} 。

碳糊电极因其具备电位窗宽、制备方便简单、易修饰和电极表面易更新等优点,成为电化学工作电极的研究热点。Liu 等用自制糊状碳电极作为工作电极研究了甲基对硫磷的循环伏安特性,并采用溶出伏安法对其作了定量检测, 发现在1-60μmol/L范围内线性良好,检测限为0.05μmol/L 。C-18 对有机物具有选择性吸附作用,是部分色谱柱和预处理萃取柱填料的主要成分,现也被用作工作电极的修饰材料。有机农药硫丹不具有明显的电化学活性, 但其对Cu ( Ⅱ) 的电信号具有抑制作用。Bakouri 等采用示差脉冲阳极溶出法以C18 修饰糊状碳电极( (C18)-modified CPE) 为工作电极, 在- 0.5-0.2V (vs. Ag/AgCl/3mol·L^-1 KCl ) 范围内对硫丹进行了间接测定,所得检测限可低至40 ng/L 。

Nafion 膜也被作为电极修饰材料用于农残分析研究。由于该材料具有良好的热稳定性和化学稳定性以及优良的离子导电性和离子穿透性,当在水中溶胀时还会呈现出类似反胶束的结构,因此被广泛应用于电化学领域。Erdoˇgdu用Nafion 涂层修饰的玻碳电极(Nafion-coated GCE) 作为工作电极,在pH = 2.0 的柠檬酸缓冲溶液中采用方波伏安法得到有机磷农药二嗪农的检测限为75 nmol/L 。
Manisankar 等用聚(3 ,4-乙基二氧噻酚) 修饰的玻碳电极(PEDOTPGCE) 作为柱端射壁安培电化学检测体系的工作电极,研究了三氯杀螨醇、高效氯氰菊酯、久效磷、毒死蜱和伏杀硫磷等5 种常见有机磷农药的电化学行为,对其方波伏安法优化后可使检测限低至1μg/L 。

2. 2 　酶修饰工作电极
许多农药对靶标酶的活性具有抑制作用,在此基础上酶修饰电极得到了广泛研究。以乙酰胆碱酯酶修饰电极为例,解释有机磷酶传感器工作原理如下: 乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的催化下可以分解为乙酸和胆碱;胆碱进一步在胆碱氧化酶的催化作用下,分解为甜菜酸和过氧化氢。由于有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制从而减少了过氧化氢的生成,通过检测过氧化氢电极的输出电流变化便可获得样品中有机磷农药的含量。

宋昭等以印刷丝网金电极为载体、以明胶包埋为主要方法制备了用乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶修饰的酶电极(AchE&ChE modified Au SPE) 。该电极作为工作电极在pH = 6.8、温度为37 ℃的条件下对氯化乙酰胆碱有最大响应。采用安培检测法对敌百虫的测定时间可控制在10min 内,测量的线性范围为10^-10 —10^-5mol/L ,检测限为1 ×10^-10mol/L 。此法制备的电极寿命可达30 天。张君等也将类似的印刷丝网乙酰胆碱酯酶修饰电极用于对硫磷检测,检测限为2.1 ng/ml 。de Oliveira Marques 等则对不同来源的乙酰胆碱酯酶固定化电极在安培检测法中分析甲胺磷的效果进行了对比研究。采用基因工程对同一来源的乙酰胆碱酯酶进行修饰,也有可能改进酶修饰电极对相应农药的检测灵敏度。Bucur 等用基因工程修饰的3 种乙酰胆碱酯酶作
为印刷丝网石墨电极的修饰材料,使氨基甲酸类农药的检测限亦达到10^-10 mol/L 。此外,Liu 等用碳纳米管组装玻碳电极研究了乙酰胆碱酯酶的水解产物胆碱的循环伏安行为,结果表明该电极能够提高胆碱的检测灵敏度,因此推断使用乙酰胆碱酯酶修饰的碳纳米管电极可以降低有机磷农药的检测限。

酶在基底电极上的固定化效果对于修饰电极的性能有很大影响。由于缺乏相应的活性基团,在以石墨为基底的印刷丝网电极上进行酶的固定化具有相当难度。Vakurov 等用电化学方法将氨基苯结合在碳电极上,然后在其表面对乙酰胆碱酯酶进行固定化,由此制得的印刷丝网酶电极作为工作电极对敌敌畏的检测限可达10^-10mol/L ; 同时他们还对增加这类电极的稳定性作了研究,提出在蔗糖-半乳糖醛酸或蔗糖2硫酸右旋糖苷稳定剂中干燥酶电极有助于增加电极的稳定性。经过类似处理,电极的寿命甚至可以超过一年。Reybier 等也对乙酰胆碱酯酶电极的固定方法作了探讨。

钴酞菁是常用的电化学催化剂,康天放等将乙酰胆碱酯酶膜固定于聚四氨基钴酞菁修饰的玻碳电极表面,利用聚四氨基钴酞菁对硫代胆碱的电催化活性,采用安培法得到对硫磷和乐果的检测限分别为7.0×10^-10mol/L 和2.6×10^-10 mol/L 。Ciucu等用酞菁染料对糊状碳电极作了化学修饰,然后将乙酰胆碱酯酶与胆碱氧化酶共同固定在一层透析膜上,在该酶工作电极上所得克百威与对氧磷的检测限为10^-10mol/L。普鲁士蓝亦被用作电化学催化剂修饰印刷酶电极用来测定有机磷农药和氨基甲酸类农药。

除了乙酰胆碱酯酶修饰电极之外,碱性磷酸酯酶和酪氨酸酶也可用作农药检测电极的修饰酶,Mazzei 等对此进行了相关报道。

大多数除草剂对绿色植物的光合作用会产生抑制作用,因此人们根据加入除草剂前后叶绿体(或类囊体膜) 光合作用产生O2 或H2O2 浓度的变化,利用光学和电化学分析方法来间接测定除草剂的含量。贺筱蓉等用聚乙烯醇2苯乙烯吡啶( PVA-SbQ) 光敏聚合物将新鲜菠菜叶绿体固定膜固定在铂电极上,制成生物传感器工作电极,在Tris-HC1 pH = 7.4缓冲液中,25 ℃下用示差脉冲伏安法通过测定H2O2含量的变化间接检测了除草剂百草枯、敌草隆、扑草净和阿特拉津。李建平等在利用PVA-SbQ 光聚合法固定类囊体膜的基础上,结合普鲁士蓝修饰电
极对过氧化氢分析的高选择性和高灵敏度,制成了检测除草剂残留的生物活性膜修饰电极,采用安培法使敌草龙、阿特拉津和敌稗的检出限均降低到10^-9 mol/L 。

酶电极高度的选择性和灵敏性使得酶法成为许多农残分析研究者首选的电极修饰方法之一。但用于农药检测的酶相对匮乏、酶修饰电极的寿命一般较短,且其稳定性受环境条件影响较大,这些不利因素成为酶电极推广的瓶颈。

2.3 　免疫法修饰工作电极
免疫分析法是基于抗原抗体的特异性识别和结合反应为基础的分析方法。由于其灵敏度和选择性高等优点,曾一度引起农残研究者们的兴趣。研究人员将制得的相应农药抗体结合在电极上,通过对半抗原或抗体进行酶标记,达到对样品中特定的农药残留物进行定性和定量的检测目的。

Dzantiev 等用安培法测定了抗体修饰的石墨电极上过氧化酶的活性,从而得到除草剂二氯苯氧基乙酸与三氯苯氧基乙酸的含量。方法经过优化,可使两种物质的检测限分别达到40ng/ml 和50ng/ml 。Keay 等制备了无分离型辣根过氧化酶修饰的酶联免疫电极,应用安培法建立了阿特拉津的检测方法,线性范围在0.01-1.0 mgPL之间。同样由于抗体的高度选择性,也限制了它的普适性。

3 　应用微工作电极的安培检测法
　　微电极有利于实现检测装置的集成便携化,同时能够在介电常数较低的有机溶剂中检测电化学活性物质,因此近年来得到了广泛的研究。

De Souza 等应用直径为25μm的金微盘电极检测了0.1mol/L NaClO4 溶液中的敌敌畏,在方波伏安测试的最佳条件下得到检测限和定量限分别为7.8μg/L 和26.0μg/L 。Hernández-Olmos 等在直径为10μm 的金微盘电极和直径8μm、长8mm 的碳纤维电极(CFME) 上研究了乙腈与乙酸乙酯中杀虫剂双硫胺甲酰的电化学行为。研究发现,微电极形状、所用溶剂以及样品浓度的改变均会影响循环伏安曲线的形状。最终采用方波伏安法在碳纤维电极上得到乙酸乙酯中双硫胺甲酰的检测限为4.3×10^-7mol/L 。有机磷农药和二吡啶基除草剂也在相
似的微电极上得以测定,该法分别使用Na2SO4、NaClO4以及Britton-Robinson 缓冲液作为百草枯、敌草快、敌敌畏以及甲基对硫磷的支持电解质,所得4种农药的检测限均低于15μg/L 。

De Souza 等以同样的金微盘电极作为工作电极,采用经过条件优化的多阶方波伏安法(MSWV),可使除草剂百草枯的检测限降低到0.044μg/L ,这一结果比采用传统的方波伏安法所得的检测限低约2-3个数量级。研究人员将此方法应用于未经处理的水样和饮料样品的检测,回收率试验表明了这一方法具有很强的实用性。

4 　集成化的农药残留安培检测法
　　为实现高效、灵敏和快速的自动化分析,与分离体系进行集成是实现安培法分析多农药残留研究的一个重要目标。已成熟的仪器分析法——高效液相色谱法[及离子交换色谱法均以修饰电极作为安培检测器的工作电极,对具有电化学活性的有机磷农药和氯代苯氧型除草剂作了分析。

近几年来,随着毛细管电泳技术和流动注射进样技术的不断成熟,将这两者与电化学安培检测器集成的应用研究开始兴起。

Chicharro 等采用毛细管胶束电动色谱作为分离方法用自制的糊状碳电极作为工作电极分析了9 种苯脲除草剂, 所得检测限均低于5.0×10^-6mol/L 。王文雷用类似的方法采用直径50μm 的碳纤维微盘电极作为工作电极分析了对氧磷、甲基对硫磷、乙基对硫磷和扑灭松,最低检测限为1.0×10^-7mol/L ,对应的质量检测限比气相色谱法低3-4
个数量级。

流动注射是1970 年代中期诞生并发展起来的溶液自动在线处理及测定的现代分析技术,具有进样速率高、响应时间快、设备较简单和便于实现微型集成化等优点,因此近几年来备受农药残留电化学研究人员的青睐。除了采用常规电极如玻碳电极和悬汞电极外,各种自制的修饰电极也被作为安培检测的工作电极随电化学体系集成到流动注射检测系统中,用来探索新的农药残留分析方法。

Rippeth 等发表了将乙酰胆碱酯酶修饰的可抛弃型钴酞菁染料印刷丝网碳电极集成到流动注射体系中,用以检测有机磷农药敌敌畏和对氧磷的方法,条件优化后的检测限可达到10^-11mol/L ,效果明显优于其它的电化学检测方法。

SchÊning 等将电化学检测装置和流动注射体系进行芯片化集成,检测器以有机磷水解酶修饰的金电极作为工作电极,测定了对氧磷和敌敌畏,最低检测限为0.1μmol/L 。基于多种胆碱酯酶修饰的电化学传感器与流动注射体系的集成化也得以研究。Grennan 等用印刷免疫传感器(HRP-scAbCPSPE) 作为检测器,采用三电极体系流动注射分析法测定了阿特拉津,检测限能够达到0.1μg/L 。Liu也采用免疫传感器安培检测法与流动注射法相结合对毒死蜱的代谢产物作了分析,最低检测浓度甚至可达6 ng/L 。

5 　农药残留安培检测法存在的问题及其发展趋势
　　综上所述,各种常规电极包括汞电极、金电极、玻碳电极、糊状碳电极等及其修饰电极,已被广泛应用于农药残留的安培检测体系,所涉及检测对象主要包括以甲基对硫磷、对硫磷、杀螟硫磷和敌敌畏等在内的数十种有机磷农药,以及数种有机氯农药和含二吡啶基除草剂,如百草枯、阿特拉津和二氯苯氧基乙酸等。仿生性农药如杀虫单等也是安培检测法研究的对象。

目前,农药的安培法检测限主要分布于mg/L-μg/L之间,多数可达到μg/L水平。尤其是采用了修饰电极的安培检测法,其灵敏度几乎相当甚至超过成熟的仪器检测法如气相色谱法和高效液相色谱法(见表1) 。而与分离体系相集成的安培检测体系,甚至可使农残代谢产物的检测限低至ng/L ,这为众多研究者们展示了安培检测法在农残分析领域的光
明前景。

由于安培检测法一般只能对工作电极上具有氧化还原性的物质进行测试,并且要求背景溶液具有导电性和化学惰性,这便使此方法的适用范围受到了限制。另外样品中可致电极中毒的表面活性剂在工作电极上的强吸附作用可能会导致二次检测的灵敏度降低,因此每一次样品分析完成后通常需要采用各种方法(溶剂浸泡或电化学方法) 彻底清洗或更换工作电极,这既增加了分析的步骤,也提高了分析样品的成本。这些均是电化学应用研究始终面临且亟待解决的问题。

为此,除了文中所提及的通过修饰、优化工作电极来提高检测的灵敏度、选择性和缩短分析时间之外,将安培检测系统与样品分离体系进行有效集成,将是改善农残电化学检测现状最有效的方法。与样品纯化和分离体系的有效集成,一方面可以降低工作电极被污染的程度,同时还可以实现高通量多种农药残留的分析。倘若还能够使具有不同选择性的工作电极可根据需要在线切换,则会进一步增加样品中农残的检测种类,从而有效拓展农残电化学检测的范围。另一方面,如果能够将集成化的分离检测系统微型化、甚至芯片化,最终使得整个电化学分析体系可供使用者随身携带,那么完全普及农作物农残的田间监测、类似样品现场检测以及其它环境的农残监控便指日可待。因此,集成便携化必将成为未来农残电化学分析研究的总趋势。这也是我们实验室目前正在研究的内容。