【转帖】色谱法系统的选择与应用

第三章 气相色谱和液相色谱的比较
1，流动相
2，固定相
3，分析对象
4，检测技术
5，制备分离

1，流动相
GC中用气体作流动相，又叫载气。常用的载气有氦气、氮气和氢气。与HPLC相比，GC流动相的种类少，可选择范围小，载气的主要作用是将样品带入GC系统进行分离，其本身对分离结果的影响很有限。而在HPLC中流动相种类多，且对分离结果的贡献很大。换一个角度看，GC的操作参数优化相对HPLC要简单一些。此外，GC载气的成本要低于HPLC流动相的成本。
2，固定相
因为GC的载气种类相对少，故其分离选择性主要通过不同的固定相来改变，尤其在填充柱GC中，固定相常由载体和涂敷在其表面的固定液组成，这对分离有决定性的影响，所以，导致了种类繁多的GC固定相的开发研究。迄今已有数百种GC固定相可供我们选择使用，但常用的HPLC固定相也就十几种。故HPLC在很大程度上要靠选用不同的流动相来改变分离选择性。不然，毛细管GC常用的固定相也不过十几种。在实际分析中，GC一般是选定一种载气，然后通过改变色谱柱（即固定相）以及操作参数（柱温和载气流速等）来优化分离，而HPLC则往往是选定色谱柱后，通过改变流动相的种类和组成以及操作参数（柱温和流动相流速等）来优化分离。
3，分析对象
GC所能直接分离的样品应是可挥发、且是热稳定的，沸点一般不超过500℃。据有关资料统计，在目前已知的化合物中，有20%到25%可用GC直接分析，其余原则上均可用HPLC分析。也就是说GC的分析对象远没有HPLC多。
4，检测技术
GC常用的检测技术有多种，比如热导检测器（TCD）、氢火焰离子化检测器（FID）、电子俘获检测器（ECD）、氮磷检测器（NPD），又叫热离子检测器（TID）等。其中FID对大部分有机化合物均有响应，且灵敏度相当高，最小检测限可达纳克（ng）级。而在HPLC中尚无通用性这么好的高灵敏度检测器。商品HPLC仪器常配的也就是紫外-可见光吸收检测器（UV-Vis）和示差检测器（RI）。前者的通用性远不及GC中的FID，后者的灵敏度又较低，且不适于梯度洗脱。当然，不论GC还是HPLC，都有一些高灵敏度的选择性检测器，GC有ECD和NPD等，HPLC则有荧光和电化学检测器。较为理想的检测器应该首推MS，但在这一点上，GC目前要优于LC。因为GC流动相的特点，它与MS的在线联用已不存在任何问题，特别是毛细管GC与MS的联用（GC/MS）已成为常规分析方法。而HPLC与MS的联用就受到了流动相的限制。虽然目前已有多种接口，如离子束、热喷雾和电喷雾等，但流动相的选择还是受到明显的限制。
5，制备分离
在新产品研究开发过程中，或在未知物的定性鉴定工作中，常需要收集色谱分离后的组分作进一步的分析，而某些高纯度的生化试剂则是直接用色谱分离来制备的。就这一点而言，GC在原理上应该是有优势的，因为收集镏分后载气很容易除去。然而，由于GC的柱容量远不及HPLC，如果用GC作制备，那是相当费时的。因此，制备GC的实用价值很有限。制备HPLC则有很广泛的应用。

第四章 分析条件的确定
1，样品信息
2，流动相
3，固定相
4，检测器

1，样品信息
分析实际样品时，必须尽量收集与样品有关的资料。（1）分析的目的是什么；（2）分析对象物质及其母体结构是什么；（3）分析对象中有多少种成分；（4）分析对象中各种成分的预想含量-主组分或微量组分；（5）分析对象物质及其母体结构的物理化学性质；（6）样品量，样品的形态；（7）检测限，测定限，灵敏度，分析时间；（8）有无分析实例和标准样品。
气相色谱的分析条件比高效液相色谱容易确定。一般而言，用吸附剂作填料，用热导检测器分析含有无机气体的样品。分析有机化合物时，应注意其最高使用温度，选用分配型液相填料，若用氢火焰离子化检测器，分析的成功率在90%以上。在高效液相色谱中，必须针对样品选择流动相和固定相的最佳组合。由于对过去的分析实例还没有归纳得像气相色谱那样完整，所以初学者难以确定分析条件。
2，流动相
在气相色谱中，流动相只影响分析时间和柱效率。若用理论塔板高度对移动相的线速度作图，则存在极小点，表明在某一确定流速下，色谱柱的效能最高。He和H2的最佳流速大于N2的最佳流速。因此，柱效相同时，要获得高流速最好用H2，从安全性考虑用He，从经济上考虑用N2。
在液相色谱中，流动相与固定相的组合取决于样品成分的保留能力。若组合不当，样品或者直接通过色谱柱，或者完全被保留而不洗脱。在液相色谱中，流动相的流速缓慢时柱效能好，但影响分析时间。应尽量采用高纯度的流动相。流动相中的不纯物与假峰、固定相寿命和检测器有关。选择液相色谱流动相时必须考虑粘度。在洗脱能力相同时，应选用粘度小的流动相。
3，固定相
在气相色谱中，一般是从制造厂家购买色谱柱填料后自己装柱。但对毛细管柱一般是购买内壁已涂覆好的成品。在液相色谱中，一般是直接购买填充柱。
对气相色谱填料，必须指明下列内容：（1）载体的种类；（2）载体的前处理方法；（3）载体的粒度范围；（4）有无减尾剂及附着量；（5）液相的种类；（6）液相量。
4，检测器
与流动相的状态相对应，气相色谱以离子化检测器为主，有氢火焰离子化检测器，热导检测器，电子俘获检测器，火焰光度检测器，氮磷检测器，质谱检测器等；而高效液相色谱则用光学和电化学的检测器，有紫外检测器，示差折光检测器，荧光检测器，电导检测器，电化学检测器，质谱检测器等。

第五章 样品的制备
1，引言
2，样品类型
3，液体样品的预处理
4，固体样品的预处理
5，柱切换
6，衍生化

1，引言
样品制备的目的是为了使试样中的干扰物质相对除净、不损害色谱柱，且能与将使用的色谱方法相兼容；即样品溶剂能快速汽化或溶于流动相而不影响样品的保留值与分离度。
样品预处理的选择
（1）样品的收集：要有代表性
（2）样品的贮藏与保存：用适宜的惰性、密封容器
（3）样品的初加工：如干燥、过筛、碾细等
（4）称重或定容稀释：有必要注意活性、不稳定组分
（5）其它的样品加工方法：溶剂替换、除盐、蒸发、冷冻干燥等
（6）除去微粒杂质：过滤、固相萃取、离心
（7）样品的提取：液体样品的提取；固体样品的提取
（8）衍生化：主要用于提高被测物的检测灵敏度，有时也用于改善分离
2，样品类型
样品基质可分为有机基质和无机基质，也可进一步再分为固体、半固体（包括乳膏剂、胶剂、混悬剂、胶体剂）、液体和气体。
与气体或固体相比，制备进行色谱分析的液体样品要容易得多。许多色谱分析就是基于“稀释即进样”的步骤；有的固体样品易于溶解，随后即可进样或进一步处理；而另一些固体基质在常规溶剂中不溶，则必须将被测物从固体基质中提取出来。
固体样品的传统萃取方法：（1）固-液萃取；（2）索氏提取；（3）强制流动浸出；（4）均匀化；（5）超声波处理；（6）溶解。
固体样品的现代萃取方法：（1）加速溶剂萃取；（2）自动索氏提取；（3）超临界流体提取；（4）微波辅助提取；（5）热提取。
3，液体样品的预处理
3.1 液-液萃取
用液-液萃取（LLE）可从干扰物中分离出被测物，通过被测物在两种不混溶的液体中的分配系数不同达到分离的目的。LLE中一相通常为水相，而另一相为有机溶剂。亲水性强的化合物进入极性的水相多，而疏水化合物将主要溶于有机溶剂中。萃取进入有机相的被测物经溶剂挥发容易回收，而提取进入水相中的被测物经常能够直接注入反相HPLC色谱柱中进行分析。
由于萃取为一平衡过程，效率有限，两相中仍存在数量可观的被测物。因此可利用包括改变pH、离子对、络合作用等的化学平衡，以提高被测物的回收率和/或消除干扰。
许多LLE操作在分液漏斗中进行，每一相的体积一般都需几十或几百毫升。当定量回收率大于99%时，需要两步或多步萃取。
与LLE有关的实际问题包括：
（1）发生乳化；（2）被测物牢固地吸附于微粒上；（3）被测物与大分子量的化合物结合；（4）两相彼此互溶。
破乳可采取下列措施：
（1）在水相中加盐；（2）加热或冷却萃取容器；（3）用玻璃棉塞或相分离滤纸过滤；（4）加少量不同的有机溶剂；（5）离心。
3.2 固相萃取（SPE）
与LLE相比较，SPE有许多优点：
（1）萃取被测物更彻底；（2）分离被测物与干扰物的效率更高；（3）降低有机溶剂消耗；（4）易于收集全部被测物；（5）手工操作更方便；（6）能除去微粒；（7）易于自动化。
SPE的分离原理、固定相的选择和方法建立都与HPLC的相类似。SPE和HPLC之间的主要差别是SPE萃取管一般只用一次即废弃掉，因为可能有潜在干扰物留于萃取管中。
用于SPE的装置有多种：（1）萃取管；（2）圆盘滤头；（3）涂布纤维。其中最普遍采用的是萃取管。
SPE的应用一般包括四个步骤：（1）润湿活化填料；（2）加样；（3）冲洗填料（除去干扰物质）；（4）回收被测物。
活化步骤有双重作用：（1）除去因萃取管暴露于实验室环境时可能聚集的杂质，净化固定相；（2）用溶剂润湿吸附剂，建立一个合适的固定相环境。一般甲醇为常用的活化溶剂。
3.3 膜分离
膜通常由合成的有机聚合物（如PTFE、尼龙或聚氯乙烯）、纤维素或玻璃纤维制作而成。滤膜在样品制备方面的主要应用为滤过和固相萃取。超滤、反渗透、渗析、微渗析和电渗析为以滤膜进行浓缩、纯化和分离被测物的技术示例。
膜技术的应用与其它样品制备技术比较，优点在于：（1）样品或基质成分超载的危险性可以忽略；（2）大多数膜过程在密封流动系统中进行，能降低污染，避免接触有毒或危险的样品；（3）使用有机溶剂量少；（4）流动系统易于实现自动化。
4，固体样品的预处理
4.1 传统的萃取方法-索氏提取法
索氏提取法是固体提取中应用最广泛的一种方法。主要优点是回收率高、成本低；缺点是时间很长（12~24小时或更长）。
在索氏提取中，被测物在提取溶剂沸点温度下必须稳定。方法建立包括寻找合适的挥发性溶剂（如沸点小于100℃），这种溶剂必须对被测物有足够大的溶解度，而对固体样品基质溶解度要小。
作为有效萃取最古老的方式，索氏提取已成为公认的标准。
4.2 新型萃取方法
（1）超临界流体萃取法（SFE）
超临界流体（SF）具有气体质量传递的性质和液体溶解度的性质，且有比液态溶剂高得多的溶剂萃取效率和速度。
能用于SFE的流体包括CO2、NH3、N2O和戊烷。其中CO2用于SFE最多。
影响CO2-SFE的主要参数包括压力、温度、流速、助溶剂和提取时间。
（2）微波辅助溶剂萃取法（MASE）
用微波源直接加热样品与提取溶剂。提取操作可通过多种条件进行控制：提取溶剂的选择，加热时间，脉冲加热或连续加热，搅拌或不搅拌，密封容器或开口容器，容器外部加冷却或不加冷却。
（3）加速溶剂提取法（ASE）
加速溶剂提取亦称为增强溶剂提取，在密闭提取容器中进行，以常用的有机溶剂在高温（50~200℃）和高压（150~2000psi）下，从固体样品中提取可溶性被测物。
5，柱切换
色谱柱切换亦称多维色谱，是分离和清除复杂的多组分样品杂质的有效技术。这种方法中，初始色谱柱（1柱）的一部分色谱组分被有选择地转送至第二支色谱柱（2柱），再次分离。
柱切换（CS）用于：（1）在2柱之前队去可能损坏色谱柱的物质；（2）在2柱之前队去强保留杂质；（3）除去在2柱中会覆盖被测物谱峰的干扰物；（4）程序升温或梯度洗脱的一种替代方法；（5）痕量富集。
对CS的一个重要的实验要求是应将被测物从1柱完全转移至2柱。这需要准确地控制切换时间。2孔至10孔的高压切换阀可以买到。CS可用单泵进行，但通常最好用多泵操作。
6，衍生化
衍生化方法使被测物与相应的试剂之间发生化学反应，以改变被测物的化学和物理性质。色谱中的衍生化有四种主要用途：（1）改善被测物的检测；（2）改变被测物的分子结构或极性，以利于色谱分析；（3）改变基质，以利于色谱分析；（4）改善被测物的不稳定性。
理想的衍生化反应应该快速、定量、产生副产物少。多余的试剂应不干扰被测物或易于从反应基质中除去。建立方法时，衍生化往往是最后才选择的手段。柱前或柱后反应的引入增加了分析的复杂性以及误差来源，也增加了分析的总时间，还要保证定量的衍生化。

第六章 定量
1，引言
2，信号的测量
3，定量方法
4，定量误差来源

1，引言
设计合理、有效的分析方法分析主成分时，应高度准确和精密（精密度：±1-2%；准确度误差为真值的2%以内）。
一种定量方法，对每一种被测物均能在较宽的样品浓度检测范围内有（良好的）线性响应是关键。
1.1 准确度，精密度和线性范围
建立良好的色谱定量方法需要给出准确度、精密度和线性范围。准确度的定义为测量值与真值接近的程度。精密度是指同一样品多次测量结果的重复程度。这种重复程度包括使用不同的仪器、操作人员、样品制备、实验室等在一天内或经过数天所得测结果的重现性。方法的线性是指响应值与样品浓度的校正曲线近似成一直线的程度，或者数据满足线性的程度。
1.2 检测限和定量限
被测物最小可检测量（LOD）指能被可靠检测的最小浓度。LOD与系统的信号和噪音有关，通常被定义为信噪比（S/N’）至少为3：1的峰。最小定量限要求S/N’比值至少为10；最大定量限，是指使用该定量方法能够测定的最大浓度。最大和最小定量限将决定方法的浓度范围。
2，信号的测量
2.1 噪音
任何信号测定的精度（与定量结果有关）匀受信号峰相对于噪音峰的大小的影响。噪音是指在没有被测物的情况下基线信号值的不稳定程度。噪音有三种基本类型：短期、长期、和基线飘移。
短期噪音（亦称高频噪音）可以由许多因素引起，包括检测器噪音、HPLC泵系统的脉动以及积分系统的电子噪音等。这种高频噪音将限制色谱检测信号的能力。
长期噪音可由外在因素或系统本身问题引起。长期噪音的起因包括：
（1）HPLC中流动相溶剂组分的在线混合不均匀会随时间产生微小变化
（2）温度波动
（3）固定相从柱中流失（尤其是在梯度洗脱过程中）
（4）前次进样中的未流出组分
基线漂移被认为是一种特殊类型的长期噪音，即使在比较完善的方法中也不可避免。基线漂移最显着的类型出现在程序升温或梯度洗脱过程中，未流出峰或以前进样的组分出峰也可能以基线飘移出现。这种基线问题常发生于等度分离中，基线飘移也会由检测器性能的改变而引起。
2.2 峰高
测定检测器对一化合物响应的最简单方式是测定其信号峰的高度，这种峰测定法对痕量分析较好。对分离良好的单一组分，峰高是基线到峰顶点间的距离，其中基线值为峰开始前至峰结束后诸多数据点的平均值。
2.3 峰面积
分离良好峰的峰面积可定义为由峰开始到峰终止的时间内的信号响应积分值。准确且精密地测定峰面积取决于很多因素。首先需确立正确的基线；其次，有必要正确地定义峰的起始和结束。第三，有必要采集的跨越该峰的数据点的数量应足够大。大多数情况下，建议跨越所需峰至少要15个点。
2.4 峰高与峰面积定量
虽然峰面积定量在色谱中应用较多，对于一个性能良好、近似对称的峰来说，峰高测定精度同峰面积，但准确度更佳。对痕量分析，峰高往往是更合理的定量方法。
3，定量方法
3.1 峰面积归一法
完成一次运行并对色谱图中所有意义的峰进行积分后，使可计算出总的峰面积。任一峰面积百分比均可视为归一化的峰面积。峰面积归一化技术正确使用的前提是假设每一种组分的响应因子完全相同，这对UV检测几乎不可能。但整体特性检测器，如热导检测器（TCD）、示差折光（RID）或蒸发光散射（ELSD）检测器却对许多化合物确实有相似的响应。
3.2 外标校正法
确定未知样品浓度的最常用方法是用外标物质作出校正曲线，根据校正曲线图解或用响应因子数值计算求出其浓度值。实际工作中建议使用两个或多个浓度的标准溶液。标准品溶液浓度应与样品的期望浓度接近。测定未知样品浓度的第二种方法是采用响应因子。
该法主要的误差来源是进样的重现性，外标法欲得到好的定量结果，分离所有标样与样品必须保持色谱条件恒定。为确保定量准确，校正最好在样品基质中进行。
3.3 内标校正
另一种校正技术包括在校正溶液和样品溶液中加入内标物。内标能补偿由于仪器变化带来的进样量或浓度的改变。使用内标的主要原因之一在于样品有时需要繁杂的预处理或制备步骤。
适宜的内标物的要求包括：
（1）能与被测物及其它峰良好分开
（2）与被测物有相似的保留值（k）
（3）原样品中不应存在
（4）在样品制备步骤中与被测物性质极相似
（5）化学性质上不必与被测物相似
（6）可能到高纯度的商品
（7）稳定，不与样品、固定相、流动相发生反应
（8）与被测物具有相似的检测器响应
内标法的测定精度不如外标法，因为需测定两个峰，而非仅被测物一个峰，加大误差。此外，选择一种不干扰其它峰的化合物也增加方法建立的复杂性。
3.4 标准加入法
标准加入法用于痕量分析最多。该法中，将不同重量的被测物加到样品基质中，开始时在基质中即已含有未知浓度的被测物。
标准加入法的重点是添加被测物前的响应要足够大，以便提供适宜的S/N’比（＞10）；否则结果精度不好。
4，定量误差的来源
色谱中好准确度取决于：
（1）样品具有代表性
（2）谱峰重叠或干扰尽可能小
（3）好的峰形
（4）用纯标准品准确的校正
（5）适宜的数据处理方法
好的精密度取决于：
（1）样品制备技术
（2）仪器重现性，包括进样技术
（3）有较高的S/N’比
（4）好的峰形
（5）适宜的数据处理方法
（6）定量及校正方法
定量结果偏差可视为所有各步偏差的总和。色谱中误差的主要来源是取样及样品制备，色谱过程，信号处理或数据处理。
4.1 样品和样品处理
样品的性质是产生准确度和精密度误差的基本原因。色谱中的样品处理牵涉到制备进样溶液。简单称释的液体样品通常精度可好于0.5%。尽量减少所需转移及稀释的次数。样品应当用流动相或用比流动相弱的溶剂制备，以保证好的峰形。手工进样的误差一般为2%~3%。样品预处理往往是色谱方法精确度差的主要来源。
4.2 色谱过程的影响
色谱方法和相关的仪器操作是定量误差的又一来源。形状不好的峰（前展或拖尾）是定量不好的主要因素。用峰面积代替峰高能改善测定精度。应选择能提供卓越信噪比的检测器条件，以准确、精密定量。最后的结果受检测器基线稳定性、短期噪音或基线漂移以及检测器对被测化合物灵敏度的影响。
4.3 数据系统的影响
现代数据分析系统多数足以测定峰面积和峰高，但必须用合适的积分参数才能得到好的定量结果。其结果取决于：
（1）系统如何滤除或均化短期噪音
（2）每秒钟采集数据点的数量
（3）设定的数据采集参数
（4）计算机处理数据的计算方法

第七章 仪器选购的原则
1，实用性原则
2，最佳性价比原则
3，良好售后服务原则
4，发展的原则

市场上有各种各样的色谱仪器，各生产厂商几乎一两年就推出一种新产品。就性能和价格而言，差别是相当大的。一台国产的普通GC仪器，3万元人民币即可购得。而一台进口的高档仪器则要10万美元，甚至更多。对用户来说，选择余地当然很大。激烈的市场竞争也为用户提供了花最少的钱买到实用仪器的途径。那么，我们如何选购一台令人满意的仪器呢？这是一个相当复杂的问题，在这里我们只能提出几条原则性建议，供购买仪器时参考。
首先让我们简单讨论一下当代色谱仪器的某些发展趋势。总的说来，色谱仪器有两个明显的发展方向，一是多功能高档型，配置齐全，可用于各种色谱分析应用。如安捷伦公司的HP6890Ⅱ型GC、HP1200型HPLC、Waters公司的超高效液相色谱仪等仪器，这类仪器主要用于研究与开发。二是实用化中档型，针对绝大多数用户的实际情况，在满足常规分析要求的前提下，尽可能降低成本，如HP6850、HP4890等型号的GC。或者针对某一类具体应用（如天然气分析）设计专门化仪器。这类仪器主要用于常规分析。当然，还有一类仪器是为特殊用途设计的，如用于野外分析的便携式GC、用于航天飞行器的微型GC。
客户购买仪器考虑的通常会有四个因素：（1）性能是否满足需要？（2）价格是否合理？（3）产品质量是否可靠？（4）售后服务是否及时保障？
现在我们来讨论购买仪器的原则。
1，实用性原则。
所谓实用就是根据自己的分析需要，选择能满足自己分析要求的仪器。因为在市场经济条件下，应该考虑投入产出比，而不应一味追求性能最好、功能齐全。举例来说，如果是学校为学生开设基础GC实验，就不一定要购置齐全的仪器，那样反倒不利于学生掌握GC仪器的基本结构。而如果是大型企业生产线上使用的工艺监测色谱仪，就必须要求性能可靠、分析速度快，不能因为监测数据出不来而影响整个生产线的运行。实用性的另一方面是购买仪器时不必带用不着的、起码是近期用不着的零配件。比如石化行业作油品分析的实验室就不一定要配备电子俘获检测器（ECD），因为TCD和FID就可以满足绝大多数分析要求了，而当你需要的时候再买来配上即可，这样在经济上是合算的。我们不应像过去计划经济条件下那样，只要申请到一笔钱就尽量一次花完。
2，最佳性能价格比的原则。
也就是花最少的钱买到最好的性能。这一条说来容易，做起来就难，需要我们在购买仪器时多作市场调研，货比多家。还要根据自己的分析要求确定哪些性能是必须达到的，哪些性能是可以降低要求的。这样就可在与厂商销售人员“砍价”时做到心中有数。要注意有些销售人员把他的产品吹得天花乱坠（这当然无可厚非），但事实上并不尽然。有的用户在购买仪器前先拿特定的样品让各厂商测试，以比较其性能，这不失为一种聪明的做法。
3，良好售后服务的原则。
要记住：仪器越先进，越要求售后服务好，因为一般操作人员不可能去修理集成电路。有的公司开通了800免费咨询服务电话，有专门技术人员值班，回答用户的问题，随时帮助用户排除故障，深受用户欢迎。而也有的厂商售后服务较差，要么维修人员少，服务不及时，要么维修人员的水平有限。良好售后服务的另一方面是技术支持，即不仅培训仪器操作和维护，还为用户提供分析方法方面的技术咨询。这样的厂商自然受用户的欢迎。注意在签订仪器购买合同时，别忘了核实售后服务方面的条款。
4，发展的原则。
即今后增加仪器配件和升级的问题。现在很多仪器是积木式（或模块式）设计，第一次购买时不一定什么都买全，当今后需要时买来接上即可使用，不致由于技术的发展而使仪器过早被淘汰。还有软件的升级问题，这方面网络化是一个值得注意的发展趋势。如果仪器有网络功能，需要时可接在局域网或国际互联网上。今后这将是一个不得不考虑的问题，尤其是一些比较大的企业和大型实验室，网络化将是一个必然要解决的问题。

很好,支持,对选择色谱有帮助!

谢谢楼主分享