【求助】关于孔雀石绿和结晶紫测定的一些问题 急！

guojl666 2008/07/31

水产品中孔雀石绿、结晶紫残留量的 快速测定方法 1 范围 本标准规定了水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱和高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]的快速测定方法。本标准适用于水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的测定。 2 原理 试样中的残留物经孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒处理，离心，取上清液旋转蒸干，流动相溶解残渣，高速离心后，微孔滤膜过滤，用高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法或高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]检测。 3试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。 3.1 乙腈:[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]纯。 3.2 甲醇：[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]纯。 3.2 无水乙酸铵。 3.3 冰乙酸:[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]纯。 3.4 5mol/l乙酸铵缓冲溶液:溶解38.5g无水乙酸铵于90ml水中，用冰乙酸调节pH到7.0，最后用水稀释到100ml。 3.5 0.1mol/l乙酸铵缓冲溶液:溶解7.71g无水乙酸铵于1000ml水中，用冰乙酸调节pH到4.5。 3.7 5mmol/l乙酸铵缓冲溶液:溶解0.385g无水乙酸铵于1000ml水中，用冰乙酸调节pH到4.5，过0.2um滤膜。 3.8 乙酸盐缓冲液：溶解4.95g无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸于950ml水中，用冰乙酸调节溶液pH到4.5，最后用水稀释到1L。 3.9 标准品: 孔雀石绿(MG)、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐色结晶紫(LCV)纯度大于98%。 3.10 标准溶液:准确称量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制成100ug/mL的标准贮备液，再用乙腈稀释配制成1ug/mL的标准溶液。-18℃避光保存。 3.11 混合标准工作溶液:用流动相稀释标准溶液(3.2.5)，配制成孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20ng/ml的混合标准溶液。0～4℃避光保存。 3.12 孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒 (中国检验检疫科学研究院研发北京陆桥商检新技术公司生产)。 4 仪器和设备 4.1 高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱联用仪:配有电喷雾(ESI)离子源。 4.2 高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]：配有紫外-可见光检测器。 4.3 匀浆机。 4.4 旋转蒸发仪。 4.5 离心机：4000r/min、8000r/min 4.6 振荡器。 4.7 聚四氟乙烯离心管:2.5 ml ，50ml，100ml，具塞。 4.8 微孔滤膜:0.45um。 4.9 超声波水浴。 5 样品制备 称样品约5.0g于50ml离心管,先加入孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中的提取剂1、用均质机以8000r/min的速度均质30s，再加入提取剂2振荡1min,4000r/min离心5min，取上清液10ml于鸡心瓶中再加入异丙醇10ml50～55℃水浴旋转蒸干。残留物用（HPLC法1ml，质谱法2.5ml）流动相溶解，溶解液放入2.5ml离心管中，8000r/min离心5min后，用微孔滤膜过滤，滤液供仪器测定。 6 测定 6.1高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱条件 参照国标GB/T19857-2005 6.2 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]测定 6.2.1 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]条件 a)色谱柱:C18柱，250mm×4.6mm(i.d.),粒度5um; b)流动相:乙腈+乙酸盐缓冲液(80+20,V/V); c)流速:1.0mL/min; d)柱温:室温; e)检测波长: 0～5.0min,618 nm; 5.0～12min,588nm;12～18min,267nm; 注:孔雀石绿618nm，结晶紫588 nm，隐色孔雀石绿、隐色结晶紫267 nm。 f)进样量：50uL 根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的保留时间约为3.9min、5.8min、13.5 min、14.7 min。 7 空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 8 结果计算与表述 按下式计算供试样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。计算结果需扣除空白值。 　　　　20VACS X＝　　　NMAS X－供试组织中待测组分的残留量，ug/kg； V－最终定容体积数，mL， A－样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫色谱峰的峰面积。 M－供试试料样品重量，g AS－孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫标准工作溶液的峰面积。 20－孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中提取剂1体积。 N－取上清液体积数，mL。 CS －孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫标准工作溶液的浓度，ug/L。 9 方法检测限 本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫检测限: 高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱法均为0.5ug/kg；高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法为2ug/kg。 10 回收率 本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫回收率: 高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱法均为均为85%～105%；高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法均为85%～105%。 11 精密度 本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的RSD为：高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱法均小于10%；高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法均均小于10%。 附 录 A （资料性附录） 图1、高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫色谱图 注：保留时间孔雀石绿4.0min、隐色孔雀石绿13.6min、结晶紫5.4min、隐色结晶紫14.7min。

paopaobing 2008/07/31

[quote]原文由 [B]Belinda He[/B] 发表: 小妹是新手，最近在做孔雀石绿（及隐色）和(及隐色），我查到很多方法中都在提取过程中加入对甲苯磺酸溶液，我查到有个帖子说对是作为离子对试剂，有利于孔雀石绿形成离子对，增加乙腈对该物质的提取效率。是这样吗？如果是请各位高手给仔细解释一下原理，那形成的离子对在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]分析时不会产生干扰吗？多谢了！[/quote] 我们试验了一段时间后，不加甲苯磺酸溶液，而是加入盐酸羟铵，还原剂，防治结晶紫被空气氧化。也增加了乙腈的量，发现离心效果比较好。

david03052120 2008/07/31

我是取5g样品加1ml对甲苯磺酸和1ml盐酸羟氨，再用乙腈提取，因为之后还要过小柱，氮吹，所以离子对不会对检测产生干扰。