【分享】western bolt

应助达人

不是很懂，请教几个问题：
在SDS-PAGE中
1.浓缩胶凝固之后，你上面说的是用水冲洗一下浓缩胶？是不是指的浓缩胶的梳孔？个人感觉是不是用电泳缓冲液冲洗效果是不是好点，用移液器吸取一点缓冲液，洗下梳孔

2.浓缩胶在凝固过程中要补胶，能否详细解释下，不是很清楚？在什么时候补？？

3.上样前，样品要煮沸5min，使蛋白质变性，请问下煮沸之后还用不用再离心了？

谢谢！

1.嗯,是的洗梳孔.因为胶凝结后会有比较多的残留缓冲液,因此洗一下.呵呵,我一般就用水了,因为电泳缓冲液我是经常重复用,有时候比较脏的了.嘿嘿

2.这个不是特别好操作,有时候分离胶倒多了,浓缩胶比较少,在凝结过程中就慢慢加一点点了.防止梳孔太浅了.

3.我煮沸之后还是会离心一下,短时间意思一下.

最好是用水，因为一般电泳缓冲液中含有表面活性剂，如SDS，这些在冲洗时产生泡沫，就没有水的冲洗效果好了。

应助达人

我是指将胶放到电泳缓冲液中之后可以用缓冲液直接冲洗了？
就是用移液器反复的冲洗梳孔几下！

这一步主要是为了除去未凝固的成分，所以一般推荐在拔出梳子之后，用水轻轻冲洗梳孔，之后再将胶放入电泳缓冲液中，进行后续电泳。

1、理论上我们用水和RUN BUFFER清洗梳孔是一样的，但是在实际运用中我们经常使用的是水，主要原因是基于几点考虑。一是水比缓冲液经济，二是水的清洗效果比缓冲液要好。如果胶的凝固效果非常好，即使省略这一步也是可行的，但对于初学者还是建议规范操作，养成良好的实验习惯。：）
2、浓缩胶在凝固过程中，一般是不建议再补胶的，只有一次成型，才能保证一个好的浓缩和分离效果，保证各个平行样品的可比对性。
3、煮沸5分钟后，严格上是要求再次离心，取上清再上样。