【求助】求助用反相做蛋白质纯度的资料，请大家帮帮忙

写一下现在遇到的几个大问题，希望大家给与帮助，谢谢了。
1、如何确定样品中的物质（目标物质和杂质，没有目标物质的标准品）都出来了，因为是用面积归一法算纯度的
2、同样的洗脱条件，同一种样品（稳定性考察，保存时间不同）为什么6个月的是三个峰，到了九个月成了一个峰
3、洗脱条件的建立需要怎么进行验证才算是合格的方法呢？

望大家指教

1.必须有标准品,否则定性很难,除非已知体系,
2.洗脱条件一样,但是柱子性能有可能改变,另就是样品已经发生改变
3.洗拖条件取决于你的主峰周边有无干扰,另外需要控制杂质是否有干扰,没有标品也是巧妇难为无米之炊